一种光交联探针和基于光交联的线粒体蛋白质富集方法技术

本发明专利技术涉及一种光交联探针和基于光交联的线粒体蛋白质富集方法，其特征在于：该探针可以靶向线粒体，在紫外光激发下与线粒体蛋白质发生原位的共价交联；随后，通过点击反应将捕获到蛋白质的探针生物素化，并利用链霉亲和素琼脂糖微球对线粒体蛋白质进行富集。本发明专利技术的优点是实验操作简单快捷，可以实现对线粒体蛋白质的高特异性的原位富集，为线粒体原位蛋白质组学研究提供了重要的技术支撑。白质组学研究提供了重要的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种光交联探针和基于光交联的线粒体蛋白质富集方法


[0001]一种光交联探针和基于光交联的线粒体蛋白质富集方法，其特征在于：该探针可以靶向线粒体，在紫外光激发下与线粒体蛋白质发生原位的共价交联；随后，通过点击反应将捕获到蛋白质的探针生物素化，并利用链霉亲和素琼脂糖微球对线粒体蛋白质进行富集。本专利技术的优点是实验操作简单快捷，可以实现对线粒体蛋白质的高特异性的原位富集，为线粒体原位蛋白质组学研究提供了重要的技术支撑。

技术介绍

[0002]线粒体是真核细胞重要的细胞器，其在细胞能量代谢(Wagner B K,Kitami T,Gilbert T J,Peck D，Ramanathan A，Schreiber S L,Golub T R,Mootha V K.Nat.Biotechnol.,2008,26:343
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351)、生物合成和细胞死亡(Soriano M E,Scorrano L.Cell,2011,145(1):15
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17；Hengartner M O.Nature,2000,407:770
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776)的调控中起关键作用，包括细胞凋亡和细胞程序性坏死。此外，线粒体还参与三羧酸循环、脂肪酸和氨基酸氧化、钙离子稳态调节等重要生理过程(Detmer S A,Chan D C.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,2007,8(11):870
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879)。由于线粒体在维持生命稳态中发挥重要作用，因此其功能异常与许多人类疾病相关，如神经退行性疾病、癌症、心脏病和糖尿病等(Heller A,Brockhoff G,GoepferichA.Eur.J.Pharm.Biopharm.,2012,82(1):1
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18；Abramov A Y,Smulders
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Srinivasan T K,Kirby D M,Acin
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Perez R,Enriquez J A,LightowlersRN,Duchen M R,Turnbull D M.Brain,2010,133:797
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807；Weinberg S E,Chandel N S.Nat.Chem.Biol.,2015,11(1):9
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15)。由于线粒体蛋白质表达异常是其功能紊乱的主要原因，而线粒体蛋白质组学正是从整体角度，分析线粒体的蛋白质组成、表达水平与修饰状态等的动态变化，旨在阐明线粒体内全部蛋白质的表达模式和功能模式，包括蛋白质的表达与存在方式(修饰方式)、结构与功能、以及蛋白质相互作用等，从而在蛋白质水平探索线粒体生理功能和相关疾病的联系(Calvo S E,Mootha V K.Annu.Rev.Genom.Hum.G,2010,11:25
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44；Wallace D C,FanW,Procaccio V.Annu.Rev.Pathol.Mech.,2010,5:297
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348)。通过线粒体蛋白质组学可系统研究正常和病变组织中线粒体蛋白分布与表达的差异，从而为研究线粒体相关疾病的分子机制和以线粒体为靶标的药物研发奠定理论基础(Jiang Y J,Wang X.J.Hematol.Oncol.,2012,5:1
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13)。
[0003]差速离心结合密度梯度离心是分离纯化线粒体的经典方法(Stimpson S E,Coorssen J R,Myers S J.Anal.Biochem.,2015,475:1
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3)。差速离心用于分离不同大小、体积和重量的细胞器(Foster L J,de Hoog C L,ZhangY,ZhangY,XieX,Mootha V K,MannM.Cell，2006,125(1):187
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199)。通过差速离心可初步分离得到线粒体，为尽量避免其它细胞器组分的干扰，需通过密度梯度离心对得到的线粒体进一步分离纯化(Hartwig S,FecklerC,LehrS,WallbrechtK,Wolgast H,M
ü
ller
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Wieland D,Kotzka J.Proteomics,2009,9(11):3209
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3214)。密度梯度离心是在离心管内通过特定介质形成连续或不连续的密度梯度，将差速离心得到的线粒体悬液置于介质顶部，悬液通过重力或离心力场作用进
一步分层和分离。然而，通过上述分级分离技术获得的线粒体蛋白不仅由于细胞器粘连导致纯度较低，容易损失或受到污染，而且分级分离的操作会损失线粒体蛋白质的原位信息。此外，为了实现线粒体亚区间蛋白质的特异提取，美国MIT大学的Ting课题组对抗坏血酸过氧化物酶(APEX)进行基因改造，可特异地“钓到”膜间隙或基质蛋白质(Martell J D,Deerinck T J,SancakY,Poulos T L,Mootha V K,Sosinsky G E,Ellisman M H,Ting A Y.Nat.Biotechnol.,2012,30:1143
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1148)。然而，APEX方法中的基因改造必将对细胞原有的蛋白质组学造成扰动，因此无法利用于野生型细胞的线粒体蛋白质组学研究。
[0004]光交联反应作为一种快速、简单和时空可控的交联工具广泛地应用于化学、生物、医学和材料等不同研究领域。在化学生物学分析中，光交联是研究蛋白质间相互作用(PPIs)，蛋白质标记等领域的强大工具。此专利，在细胞水平使用基于光交联的线粒体靶向的蛋白质探针，利用波长为365nm的紫外光激发，从而使蛋白质探针与线粒体蛋白质中的赖氨酸发生原位的共价交联。然后，通过点击反应将捕获到蛋白质的探针生物素化，并利用链霉亲和素琼脂糖微球将其富集。本专利技术可以实现对线粒体蛋白质的高特异性的原位富集，可用于线粒体在能量代谢、生物合成和细胞死亡过程中的分子机理研究，线粒体相关疾病的分子机制阐释，以及以线粒体为靶标的药物研发，为线粒体原位蛋白质组学研究提供了重要的技术支撑。

技术实现思路

[0005]本专利技术涉及一种光交联探针和基于光交联的线粒体蛋白质富集方法，其特征在于：该探针可以靶向线粒体，在紫外光激发下与线粒体蛋白质发生原位的共价交联；随后，通过点击反应将捕获到蛋白质的探针生物素化，并利用链霉亲和素琼脂糖微球对线粒体蛋白质进行富集。本专利技术的优点是实验操作简单快捷，可以实现对线粒体蛋白质的高特异性的原位富集，为线粒体原位蛋白质组学研究提供了重要的技术支撑。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007](1)设计并合成靶向线粒体的光交联探针。该探针包括以下三个组成部分(1)光交联基团——邻硝基苯甲醇；(2)线粒体靶向基团——三苯基膦；(3)可富集基团——炔基。合成路线如式一，
[0008](2)探针在紫外光激发下与线粒体蛋白质发生原位的共价交联。过程为：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种光交联探针，其特征在于：结构通式如下：其中，n为1
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10。2.一种基于光交联的线粒体蛋白质富集方法，其特征在于：采用权利要求1所述探针，其包括以下三个组成部分：(1)光交联基团——邻硝基苯甲醇基团(o
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NBA)；(2)线粒体靶向基团——三苯基膦基团(TTP)；(3)可富集基团——炔基；该探针可以靶向线粒体，在紫外光激发下与线粒体蛋白质发生原位的共价交联；随后，通过点击反应将捕获到蛋白质的探针生物素化，并利用链霉亲和素琼脂糖微球对蛋白质进行富集。3.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于：靶向线粒体的光交联探针，其光交联基团为o
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NBA，该基团在紫外光照射下发生光致异构，从而生成中间体——邻亚硝基苯甲醛，该中间体能够在生理条件下与赖氨酸的侧链氨基以及蛋白质的N端氨基发生共价结合；该基团在能量密度为25
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10000μW/cm2级别紫外光照射下，即可实现完全激活为邻亚硝基苯甲醛；探针的线粒体靶向基团为TPP；，TPP通过醚键与邻硝基苯甲醇基团连接；该醚键在紫外光照射下发生断裂，TPP基团从探针上离去；探针的可富集基团为炔基，适用于任意一种基于点击化学的富集策略，包括通过点击化学反应引入生物素，然后利用链霉亲和素琼脂糖微球进行富集反应。4.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于，紫外光的照射可同时实现两个功能：o
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NBA的激活和TPP的离去。5.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于，该方法适用于培养细胞系，组织细胞，组织切片以及动物活体等中一种或二种以上中的线粒体蛋白质的富集。6.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于，该方法通过富集线粒体蛋白质，可用于线粒体在能量代谢、生物合成和细胞死亡过程中的分子机理研究，线粒体相关疾病的分子机制阐释，或以线粒体为靶标的药物研发。7.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于：探针在紫外光激发下与线粒体蛋白质发生原位的共价交联的过程为，A、使用PBS缓冲液配制摩尔浓度为2
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10mM光交联探针溶液；细胞置于光交联探针溶液中孵育2
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20min后，探针将富集于细胞的线粒体中；随后，将细胞置于冰上并使用紫外光照射2
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20min，随后，将细胞置于培养箱中孵育30
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60min；细胞溶液离心后，去除上清溶液并加入预冷的PBS缓冲液清洗1
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6次，得细胞沉淀；往细胞沉淀中加入终浓度1
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4％SDS溶液反复吹打，并使用细胞超声破碎仪超声，得细胞裂解液；或B、使用PBS缓冲液配制终浓度为2
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10mM的光交联探针溶液。将组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，陈宇文，赵群，杨开广，戴忠鹏，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：