一种光交联探针和基于光交联的线粒体蛋白质富集方法技术

本发明专利技术涉及一种光交联探针和基于光交联的线粒体蛋白质富集方法，其特征在于：该探针可以靶向线粒体，在紫外光激发下与线粒体蛋白质发生原位的共价交联；随后，通过点击反应将捕获到蛋白质的探针生物素化，并利用链霉亲和素琼脂糖微球对线粒体蛋白质进行富集。本发明专利技术的优点是实验操作简单快捷，可以实现对线粒体蛋白质的高特异性的原位富集，为线粒体原位蛋白质组学研究提供了重要的技术支撑。白质组学研究提供了重要的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种光交联探针和基于光交联的线粒体蛋白质富集方法


[0001]一种光交联探针和基于光交联的线粒体蛋白质富集方法，其特征在于：该探针可以靶向线粒体，在紫外光激发下与线粒体蛋白质发生原位的共价交联；随后，通过点击反应将捕获到蛋白质的探针生物素化，并利用链霉亲和素琼脂糖微球对线粒体蛋白质进行富集。本专利技术的优点是实验操作简单快捷，可以实现对线粒体蛋白质的高特异性的原位富集，为线粒体原位蛋白质组学研究提供了重要的技术支撑。

技术介绍

[0002]线粒体是真核细胞重要的细胞器，其在细胞能量代谢(Wagner B K,Kitami T,Gilbert T J,Peck D，Ramanathan A，Schreiber S L,Golub T R,Mootha V K.Nat.Biotechnol.,2008,26:343
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351)、生物合成和细胞死亡(Soriano M E,Scorrano L.Cell,2011,145(1):15
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17；Hengartner M O.Nature,2000,407:770...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种光交联探针，其特征在于：结构通式如下：其中，n为1
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10。2.一种基于光交联的线粒体蛋白质富集方法，其特征在于：采用权利要求1所述探针，其包括以下三个组成部分：(1)光交联基团——邻硝基苯甲醇基团(o
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NBA)；(2)线粒体靶向基团——三苯基膦基团(TTP)；(3)可富集基团——炔基；该探针可以靶向线粒体，在紫外光激发下与线粒体蛋白质发生原位的共价交联；随后，通过点击反应将捕获到蛋白质的探针生物素化，并利用链霉亲和素琼脂糖微球对蛋白质进行富集。3.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于：靶向线粒体的光交联探针，其光交联基团为o
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NBA，该基团在紫外光照射下发生光致异构，从而生成中间体——邻亚硝基苯甲醛，该中间体能够在生理条件下与赖氨酸的侧链氨基以及蛋白质的N端氨基发生共价结合；该基团在能量密度为25
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10000μW/cm2级别紫外光照射下，即可实现完全激活为邻亚硝基苯甲醛；探针的线粒体靶向基团为TPP；，TPP通过醚键与邻硝基苯甲醇基团连接；该醚键在紫外光照射下发生断裂，TPP基团从探针上离去；探针的可富集基团为炔基，适用于任意一种基于点击化学的富集策略，包括通过点击化学反应引入生物素，然后利用链霉亲和素琼脂糖微球进行富集反应。4.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于，紫外光的照射可同时实现两个功能：o
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NBA的激活和TPP的离去。5.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于，该方法适用于培养细胞系，组织细胞，组织切片以及动物活体等中一种或二种以上中的线粒体蛋白质的富集。6.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于，该方法通过富集线粒体蛋白质，可用于线粒体在能量代谢、生物合成和细胞死亡过程中的分子机理研究，线粒体相关疾病的分子机制阐释，或以线粒体为靶标的药物研发。7.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于：探针在紫外光激发下与线粒体蛋白质发生原位的共价交联的过程为，A、使用PBS缓冲液配制摩尔浓度为2
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10mM光交联探针溶液；细胞置于光交联探针溶液中孵育2
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20min后，探针将富集于细胞的线粒体中；随后，将细胞置于冰上并使用紫外光照射2
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20min，随后，将细胞置于培养箱中孵育30
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60min；细胞溶液离心后，去除上清溶液并加入预冷的PBS缓冲液清洗1
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6次，得细胞沉淀；往细胞沉淀中加入终浓度1
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4％SDS溶液反复吹打，并使用细胞超声破碎仪超声，得细胞裂解液；或B、使用PBS缓冲液配制终浓度为2
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10mM的光交联探针溶液。将组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，陈宇文，赵群，杨开广，戴忠鹏，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：