一种靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体的研制及其应用方法。采用纳米沉淀、乳液聚合的方法，以生物相容性较好的聚乙二醇及聚(乳酸

【技术实现步骤摘要】
一种靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体和应用


[0001]本专利技术涉及一种用于靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体的研制及其应用方法，属于生物分析


技术介绍

[0002]载体转运是药物转运的一种特殊形似，化学物质与生物膜一侧的载体分子结合可由一侧移向另一侧。转运能力受结合的饱和度或多种物质竞争性抑制作用的影响。可分为：(1)主动转运，即逆浓度(或电化学)梯度转运，需消耗一定能量。(2)易化扩散，即顺浓度梯度转运，不消耗能量。聚(乳酸
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羟基乙酸)以其生物相容性和极低的毒性而闻名。聚(乳酸
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羟基乙酸)经过降解会产生乳酸和乙醇酸副产物，它们可以进入细胞代谢途径，因此它是最有前途的可生物降解聚合物的载体材料之一，且能够获得监管机构的认可并进入市场(Journal of Controlled Release，2018，289:10
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13.)。
[0003]叶绿体是植物生物工程的关键细胞器，是植物唯一能够进行光合作用的细胞器，并且对于改善作物生长、开发合成生物学等至关重要。蛋白质N末端含有一个信号序列，称之为转运肽。目前已经运用了多种不同方法研究靶向肽序列，具有如下性质：含有大量的羟基化氨基酸和丙氨酸、缺少酸性氨基酸、存在短序列基元、疏水环境中易形成α螺旋结构。叶绿体缺乏基因沉默途径，并且已被证明具有高而稳定的转基因表达。由于叶绿体在大多数植物物种中都是母系遗传的，因此它们在转化的农作物中提供了遗传抑制作用。尽管生物技术取得了数十年的进步，但许多植物物种及其质体仍然难以进行遗传转化。目前，几乎没有能够将生物分子转移到植物细胞及其亚细胞器区室中的传递工具，每个传递工具都有局限性(Molecular Plant,2019,12(8):1037
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1040.)。用于植物传递的另一种常用工具是生物弹颗粒递送，可以将生物分子传递到更广泛的植物物种和质体组织中，但面临着低水平以及植物组织在高轰炸压力下受到损害的局限性，并且该种方法需要专门的设备及昂贵的材料。缺乏可以穿过刚性和多层细胞壁以及细胞器的双层脂质、将生物分子传递到植物细胞中的工具，这是纳米技术无法促进植物工程发展的重大瓶颈。
[0004]近年来，化学交联的蛋白质复合物并通过交联残基的质谱鉴定已成为结构生物学的重要技术之一，化学交联剂是交联质谱的核心(Dissertations&Theses
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Gradworks，2014，53(30):4924
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2930.)。光合作用通过一系列蛋白质复合物运行，这些蛋白质复合物收集阳光并将其转化为化学能，大型组织及其之间的相互作用尚不清楚。目前，对于光合作用相关蛋白质复合物的研究都是将相关蛋白提取纯化，这种方法虽然能解析部分相互作用蛋白，但是提取纯化的过程无法实现原位分析，造成一定交联信息的损失。
[0005]在本专利中，针对现有交联剂无法跨植物细胞进行原位交联，以及载体无法更精准地靶向递送的困难问题，发展了种用于靶向叶绿体的交联剂转运载体的研制及其应用方法，以实现载体转运交联剂跨植物细胞膜实现原位交联,为后期光合作用相关蛋白质复合物的原位分析奠定了基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术涉及一种用于靶向叶绿体的交联剂转运载体的研制及其应用方法，以实现载体跨膜转运交联剂获取原位交联信息。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0008]1.采用乳液聚合法制备转运载体，其步骤包括：将聚(乳酸
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羟基乙酸)、聚乙二醇、交联剂和双十二烷基二甲基溴化铵以一定的比例溶于油相中，该油相不与水互溶且易挥发；将油相分散于水相中，并借助超声均匀分散，载体材料在水相中自组装形成乳胶粒；将初次分散的水相二次固化，通过机械搅拌，液滴固化稳定，形成载体；将液滴均匀分散的悬浊液通过离心作用去除多余的水分及分散剂，沉淀经冷冻干燥，得到载体颗粒。
[0009]2.采用纳米沉淀法制备转运载体，其步骤包括：将聚(乳酸
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羟基乙酸)、聚乙二醇、交联剂和双十二烷基二甲基溴化铵以一定的比例溶于油相中，该油相可溶于水且易挥发；将油相逐滴加入水相，再经机械搅拌，固化一段时间；通过旋蒸快速去除油相；通过离心去除多余水相，最后冷冻干燥得到载体颗粒。
[0010]3.载体表面修饰信号肽，信号肽应具有靶向的序列。信号肽的筛选主要应用噬菌体表面展示技术，从随机的多肽库中筛选与特异配体或植物细胞结合的环形多肽。根据叶绿体的输入机制，所选信号肽一端用于叶绿体外膜导入机制的识别位点，另一段与载体表面键合。所选信号肽序列为植物细胞中高度保守的序列，并包含功能性生物识别基序，允许跨过叶绿体双膜。
[0011]4.靶向转运载体所包裹的交联剂结构为：其两侧为可与蛋白中的氨基反应的琥珀酰亚胺基团，琥珀酰亚胺酯具有胺类反应活性和强交联能力，可与伯氨或仲氨反应产生稳定的酰胺或亚酰胺键。
[0012]5.靶向叶绿体的特定位置包括叶绿体内膜、叶绿体外膜、类囊体、基质。
[0013]6.转运载体与植物细胞在26℃下，共同孵育2
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4h，并收集细胞，也可以进一步收集细胞内特定部位。植物细胞为无壁的原生质体；特定部位为叶绿体。
[0014]7.将获得的细胞或叶绿体中加入离子液体并通过超声提取出蛋白质。取适量的蛋白加入二硫苏糖醇，56℃或95℃高温变性，将样品转移至滤膜上。再经吲哚
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乙酸室温避光孵育烷基化，后加入适量胰蛋白酶，37℃酶解过夜。离心收集样品。
[0015]8.获得的肽段需经过高精度及高分辨的质谱仪器进行分析，需采用plink进行对质谱数据进行解析，筛选出可信度较高的相互作用蛋白，获得叶绿体内的原位交联信息。
[0016]叶绿体的输入机制是通过叶绿体外膜上的转运蛋白TOC和位于内膜上的转运蛋白TIC协同调控的，信号肽经TOC/TIC特异性识别后，引导载体穿过叶绿体双层膜进入特定生长时期的叶绿体。特定的叶绿体信号肽与叶绿体输入机制密切相关，其蛋白来源为CrPDAT、GAP3，其CTPs类型为CTP1。
[0017]当载体进入细胞中，经靶向肽的趋动以及材料表面的静电作用，实现特定位置递送。基于载体递送交联剂至叶绿体内，提取蛋白质及其复合物的原位信息，并利用高分辨质谱对蛋白质及其复合物进行解析。该种材料解决了交联剂跨植物细胞膜实现原位交联的障碍,为后期光合作用相关蛋白质复合物的原位分析奠定了基础。
[0018]本专利技术具有如下优点：
[0019](1)本专利技术通过载体转运交联剂，保护交联剂，防止其在跨植物细胞膜时被多糖消
耗。
[0020](2)本专利技术通过修饰信号肽，使得转运载体能够特定地进入叶绿体，交联剂原位释放，提高了交联信息的可用性。
[0021](3)本专利技术通过载体的手段，实现植物细胞中原位交联，从而获得了更多与光合作用相关蛋白质复合物的交联信息。
附图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体，其特征在于：以聚(乳酸
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羟基乙酸)和聚乙二醇为载体材料，以双十二烷基二甲基溴化铵使载体外表呈正电，并将交联剂包裹于其中；再经叶绿体信号肽修饰获得。2.如权利要求1所述的转运载体，其特征在于：包裹有交联剂的转运载体的制备过程为，A、通过乳液聚合法制备包裹有交联剂的转运载体，其步骤包括：(1)将聚(乳酸
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羟基乙酸)、聚乙二醇、交联剂和带正电作用的双十二烷基二甲基溴化铵溶于油相中；(2)将油相分散于水中，油相与水的体积比范围为1:5
‑
1:10，载体材料在水相中自组装形成乳胶粒；(3)将在水相中自组装形成乳胶粒,搅拌15min
‑
1h，液滴固化稳定，形成载体悬浊液；(4)将悬浊液通过离心作用16000
‑
20000g/min，15
‑
40min去除水及油相，沉淀经干燥，得到载体颗粒；(5)：在载体表面偶联信号肽，将信号肽和载体溶于二甲基甲酰胺中，避光室温摇床反应24
‑
48小时，16000
‑
20000g/min，离心30
‑
40分钟，得到载体颗粒，用水清洗1
‑
3遍，16000
‑
20000g/min，离心30
‑
40分钟，取得沉淀后干燥得到载体颗粒；或B、通过纳米沉淀法制备交联转运载体，其步骤包括：(1)将带正电作用的双十二烷基二甲基溴化铵、交联剂、聚(乳酸
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羟基乙酸)和聚乙二醇溶于油相中；(2)将油相逐滴加入水中，油相与水的体积比范围为1:5
‑
1:10，搅拌15min
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1h，固化；(3)30℃蒸发5
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15min，去除油相；(4)通过离心12000
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20000g/min，15
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40min去除多余水，最后干燥得到载体颗粒；(5)在载体表面偶联信号肽，将信号肽和载体溶于二甲基甲酰胺中，避光室温摇床反应24
‑
48小时，12000
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20000g/min，离心30
‑
40分钟，得到载体颗粒，用水清洗1
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3遍，12000
‑
20000g/min，离心30
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40分钟，取得沉淀后干燥得到载体颗粒。3.如权利要求1或2所述的转运载体，其特征在于：所包裹的交联剂包括：其两侧中的一侧或二侧为具有可与蛋白中的氨基反应的琥珀酰亚胺基团的化合物，琥珀酰亚胺酯具有胺类反应活性和强交联能力；或两侧中的一侧或二侧为具有可与伯氨和/或仲氨反应产生稳定的酰胺和/或亚酰胺基团的化合物。4.如权利要求3所述的靶向载体，其特征在于：连接两侧基团的中部链为C7
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C15碳链的烷基，信号肽与载体颗粒的的质量比范围为1:20
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1:40。5.如权利要求2所述的转运...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，李欣蔚，杨开广，曹旭鹏，江静，陈玉宛，周雯，梁振，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：