一种核酸-脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术基于冷冻干燥工艺的物理化学原理，对于核酸

【技术实现步骤摘要】
一种核酸
‑
脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种核酸
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脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒肺炎（COVID
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19）疫情中，mRNA疫苗具有安全、免疫应答高和生产成本低的优势，同时获得美国和欧盟紧急获批上市。近年来，研究发现由mRNA诱导的瞬时蛋白表达在其他传染病疫苗、癌症疫苗、心血管疾病、蛋白质替代疗法和遗传病等多领域均具有巨大的应用价值，甚至能够通过体内注射实现自主产生CAR
‑
T效应。然而，与绝大多数疫苗的储存条件（2
‑
8℃）不同，已上市mRNA疫苗长期稳定性差，需超低温保存（
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20℃，甚至
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70℃），且有效期低于6个月。在面临数亿剂mRNA疫苗需要储存，运输和分发到世界各地的情况下，稳定性成为其应用的瓶颈问题。
[0003]首先，mRNA链长为1000至5000个碱基长度，早期研究中已发现裸mRNA会被核糖核酸酶（RNase）迅速水解，而RNase无处不在，体内外均有大量附着，需要特殊处理才能去除。除此之外，mRNA长链上仅一个变化（键断裂或碱基的氧化）即会终止翻译，故mRNA疫苗中mRNA分子的完整性至关重要。
[0004]在mRNA疫苗中为了提高mRNA体内作用效力，以LNP包载递送mRNA，不仅保护mRNA避免被体内RNase瞬时破坏，而且突破mRNA与细胞膜均带负电荷的静电排斥屏障，增强向抗原递呈细胞的递送。然而，mRNA
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LNP注射液长期稳定性不佳，与其相反，siRNA
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LNP注射液稳定性良好：Onpattro与mRNA
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1273中的LNP十分相似，却具有2
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8℃，3年有效期。除此之外，Suzuki等构建的siRNA
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LNP注射液4 ℃放置1.5年，稳定性良好。siRNA分子量小且为双链结构，mRNA链长超过siRNA 100倍以上且为单链结构，后者分子结构更不稳定，更易发生水解，上述研究表明LNP在注射液中不能起到保护mRNA长期稳定的作用。
[0005]LNP由四种主要成分组成：中性磷脂、胆固醇、聚乙二醇（PEG）
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脂质和可电离阳离子脂质。研究发现mRNA
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LNP为核
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壳结构，具有表面层和一个无定形、各向同性的核心。Viger Gra等利用NMR波谱发现两种类型的核心是可能的：无定形核包含被阳离子脂质包围的水孔；或核心中的脂质可以均匀分散，中间有小水袋。Arteta等和Sebastiani等发现中性磷脂和PEG脂质以及部分可电离阳离子脂质和胆固醇位于LNP表面，而可电离阳离子脂质、胆固醇、水和mRNA位于核心区域。研究表明LNP核心含水24%，mRNA位于被阳离子脂质包围的水柱内。
[0006]冷冻干燥，又称升华干燥，根据水的三相图将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法。近年来，冻干产品占FDA和EMA批准生物药品的一半以上。在纳米制剂领域，Ambisome
®
和Vyxeos
®
均为冻干脂质体制剂，二者保质期可达36个月。辉瑞病毒疫苗研究主管Dormitzer表示公司有意开发mRNA
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LNP冻干制剂。然而，目前关于mRNA
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LNP冻干条件的研究很少，虽然均为纳米制剂，但脂质体是磷
脂双分子层形成的闭合囊泡，且用于冻干的脂质体包载的皆为小分子药物；mRNA
‑
LNP为壳
‑
核结构，外层仅为磷脂单分子层，核心包载的mRNA不仅分子量大，且对于mRNA分子的完整性要求极高，mRNA
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LNP需要在真空冷冻干燥的高强度压力变化过程中，保持其磷脂层和纳米结构不被破坏，保证mRNA的包载状态不发生变化，并在复水重构后恢复原液粒径分布及mRNA包封率，这些都具有很高的挑战性。Zhao等制备了一种新型类脂质纳米颗粒用于mRNA递送的冻干制剂，虽然mRNA复水制剂与原液体外细胞活性无显著差异，但却不具备体内活性，尚不清楚原因。Ai LX等以LNP分别包载SARS
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CoV
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2 野生型、Delta株和Omicron株的S蛋白mRNA序列，可于4℃、25℃和40℃储存18天，Muramatsu等制备了mRNA
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LNP冻干制剂，可于4℃储存24周，且体内外生物活性无显著差异。可见不同冻干条件制备的mRNA疫苗体内生物活性差异极大，提示不同的冻干程序曲线和保护剂对于制剂性能有很大影响，但对其中的作用机理和规律尚未见文献报道。
[0007]冷冻干燥工艺主要包括冻干程序曲线和保护剂两方面内容。冻干程序曲线是冻干过程中的温度、真空度及能量等随时间变化的曲线，一般包括三个阶段：预冻，升华干燥和解吸干燥。其中，冷却温度、升温速率及维持时长等均对于冻干粉的外观、水分、粒径等有重要影响。冻干保护剂，如蔗糖、海藻糖、乳糖和甘露醇等，可于干燥脱水过程中取代脂质分子与水分子间的氢键来稳定LNP结构，并起到赋形剂的作用。冻干保护剂种类、用量及添加顺序，均使其与mRNA
‑
LNP的分子作用机制及微观空间作用不同，对冻干粉中的LNP膜结构，mRNA包封率，mRNA完整性等有很大影响。综上所述，冻干程序曲线和保护剂对mRNA
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LNP冻干粉的微观结构、关键理化性质及生物活性的影响，亟需深入探究。
[0008]现有技术中的冻干工艺关键参数常为“经验式”应用，一般冷冻干燥工艺从预冻至解析干燥结束，需要30
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100小时，耗费能源是一个方面，另一方面也大大增加了产品放大生产的时间成本，如专利技术专利CN 110714015 B中优选的冻干程序为“预冻温度为
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50℃,温度保持5小时。一次冻干温度为
‑
40℃ 24小时，二次冻干温度为10℃保持17小时，冻干过程真空度为40μbar。”共耗时46小时。Muramatsu等制备mRNA
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LNP冻干制剂的冷冻干燥程序共耗时84小时。

技术实现思路

[0009]本专利技术的第一目的在于提高核酸
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脂质纳米颗粒的储存稳定性，一方面将储存条件降低为冷藏即可（2
‑
8℃），另一方面可延长有效期。
[0010]本专利技术的第二目的在于可显著缩短冻干程序总时长，提高效率，降低生产的能源和时间成本。
[0011]本专利技术的第三目的在于针对核酸
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脂质纳米颗粒筛选出特定种类及用量的冻干保护剂，充分保持其冻干复水制剂的核酸总量、包封率和完整性，并具有无损的体内外生物活性。
[0012]本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸
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脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护剂，其特征在于，包括以下组分：蔗糖、海藻糖，所述蔗糖与海藻糖的质量比为5
‑
15：5
‑
11。2.根据权利要求1所述的用于核酸
‑
脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护剂，其特征在于，还包括：甘露醇、葡萄糖或乳糖中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的用于核酸
‑
脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护剂，其特征在于，蔗糖：海藻糖：甘露醇或葡萄糖或乳糖的质量比为5
‑
15：5
‑
11：1
‑
5。4.一种权利要求1所述的核酸
‑
脂质纳米颗粒的冷冻干燥剂的制备方法，其特征在于，按照相应配比，将蔗糖、海藻糖溶解在无核酸酶水中。5.根据权利要求4所述的核酸
‑
脂质纳米颗粒的冷冻干燥剂的制备方法，其特征在于，按照相应配比，将蔗糖、海藻糖、甘露醇或葡萄糖或乳糖溶解在无核酸酶水中。6.根据权利要求1
‑
3任一项所述的用于核酸
‑
脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护剂在制备药物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将核酸
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脂质纳米颗粒加入到所述冻干保护剂的溶液中进行冷冻干燥。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，冷冻干燥包括以下步骤：预冻阶段、升华干燥、解吸干燥。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述预冻阶段：温度为
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80℃～
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50℃，预冻时间为2～6小时。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述升华干燥阶段：温...

【专利技术属性】
技术研发人员：王浩猛，李明媛，严志红，贾琳，刘健，马文林，邱东旭，谢焱博，宇学峰，郁彭，朱涛，
申请(专利权)人：康希诺上海生物研发有限公司，
类型：发明
国别省市：