裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，该方法是以裂殖壶菌为生产菌株，在发酵培养基中添加恩西地平，发酵生产多不饱和脂肪酸。本发明专利技术通过激活裂殖壶菌部分ELO/DES途径，提高裂殖壶菌发酵产物中EPA和DHA含量，采用裂殖壶菌工程菌EDG为生产菌株，使发酵产物中EPA含量提高8.73倍，DHA含量提高1.15倍。DHA含量提高1.15倍。

【技术实现步骤摘要】
裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种裂殖壶菌的发酵方法，具体地说是裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法。

技术介绍

[0002]裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)是一种富含油脂的破囊壶菌属异养海洋原生生物，因其生长速度快、易于培养等特点，被广泛应用于科研和商业生产。裂殖壶菌的脂肪酸积累以DHA(二十二碳六烯酸)、DPA(二十二碳五烯酸)、十六碳酸和十四碳酸为主，而在不同裂殖壶菌菌株中，对心血管疾病和COVID
‑
19感染愈后更有帮助的EPA(二十碳五烯酸)等多不饱和脂肪酸(PUFA)产量不同。
[0003]裂殖壶菌HX
‑
308产生的脂肪酸中，以十六碳酸和十四碳酸为代表的饱和脂肪酸占比达30％以上，PUFA约占总比例的60％，但其中各种PUFA含量不同，在药品、保健品开发等领域应用价值更高的EPA和DHA的含量有待进一步提高。
[0004]裂殖壶菌HX
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308中的ELO/DES途径是不健全的，通过对裂殖壶菌HX
‑
308的全基因组进行分析，发现裂殖壶菌HX
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308中仅以十六碳酸为底物，通过ELO/DES途径合成EPA的部分途径保持完整，且该途径涉及的转录组中转录水平非常低(Bi et al.,(2018).Transcriptome and gene expression analysis of docosahexaenoic acid producer Schizochytrium sp.under different oxygen supply conditions)。因此，采用现有发酵技术，裂殖壶菌HX
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308的发酵产物中十六碳酸比例约占20％，EPA和DHA的含量较低。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的，是要提供一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，通过外源添加恩西地平，激活裂殖壶菌部分ELO/DES途径，达到提高裂殖壶菌发酵产物中EPA和DHA含量的目的。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0007]一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，以裂殖壶菌为生产菌株发酵生产多烯不饱和脂肪酸，在发酵培养基中添加恩西地平；
[0008]其中，发酵培养基和恩西地平的用量比例为1L：1～50mmol。
[0009]制得发酵培养基的pH值为6.0～7.5，制成其的原料包括：葡萄糖60～100g/L、酵母浸粉5～15g/L、硫酸钠5～12g/L、硫酸镁2～4g/L、硫酸铵4～8g/L、氯化钾1～2g/L、氯化钙0.1～0.2g/L、硫酸钾0.5～1g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、谷氨酸钠15～20g/L、七水合硫酸锌1～5mg/L、六水合氯化钴0.01～0.1mg/L、五水合硫酸铜2～6mg/L、六水合硫酸镍1～2mg/L、七水合硫酸铁8～15mg/L、泛酸钙2～4mg/L、四水合氯化锰3～5mg/L、二水合钼酸钠0.02～0.06mg/L、维生素B
6 4～10mg/L和维生素B
12 0.1～0.5mg/L。
[0010]进一步地，所述发酵用菌种通过以下方法得到：将所述裂殖壶菌接种于种子培养基中，培养获得一级种子；取所述一级种子接种于种子培养基中，培养获得二级种子；取所
述二级种子接种于种子培养基中，培养获得三级种子，作为生产菌株；
[0011]其中，所述培养的条件为25～30℃，150～250r/min振摇培养；
[0012]种子培养基的pH为6.6，且包括：葡萄糖50g/L、酵母浸粉5g/L、硫酸钠5g/L、硫酸镁2g/L、硫酸铵6g/L、氯化钾1g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸钾0.6g/L、磷酸二氢钾1g/L、谷氨酸钠10g/L、0.1％的微量矿物质、维生素B
6 5mg/L及维生素B
12 0.5mg/L。
[0013]作为本专利技术的一种限定，所述裂殖壶菌为裂殖壶菌HX
‑
308(Schizochytrium sp.)，其保藏编号为CCTCC No.M209059。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且已在专利号为201510417269.4的中国专利技术专利公开。
[0014]作为本专利技术的另一种限定，所述裂殖壶菌是以裂殖壶菌HX
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308为野生型，且过表达裂殖壶菌C18延长酶(C18 ELO)基因和裂殖壶菌n3去饱和酶(n3DES)基因的裂殖壶菌工程菌，记为裂殖壶菌工程菌ED。
[0015]作为本专利技术的进一步限定，所述裂殖壶菌工程菌是将克隆所得的裂殖壶菌HX
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308的C18延长酶基因和裂殖壶菌HX
‑
308的n3去饱和酶基因，通过同源重组技术，连接入pBS
‑
Zeo载体后，转化至裂殖壶菌HX
‑
308所得。
[0016]作为本专利技术的第三种限定，所述裂殖壶菌为以裂殖壶菌HX
‑
308为野生型，且过表达裂殖壶菌n3去饱和酶基因和突变后的裂殖壶菌C18延长酶基因(C18ELO
‑
G)的裂殖壶菌工程菌，记为裂殖壶菌工程菌EDG。
[0017]作为本专利技术的进一步限定，所述突变后的裂殖壶菌C18延长酶基因的突变位点包括：第43位氨基酸由笨丙氨酸突变为丝氨酸，第103位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸，第122位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸，第150位氨基酸由苏氨酸突变为蛋氨酸，第201位氨基酸由酪氨酸突变为组氨酸且第229位氨基酸由半胱氨酸突变为精氨酸。
[0018]突变后的裂殖壶菌C18延长酶基因序列为：
[0019]ATGCTCGAGGGGATCAAGAACATTGACGTGGCGCAGCTGGCGCCGCTGTACGATGATCTGTACATGCTGGTTCCGATCTACGCCCTGGGCGTGCCCCTGCTCAGGGCCCACTACAAGGGCGTGCCCTCCAACGCCGGGCTCTGGAAACCCATCATGGTCGTTTACAATGCGATCATGACGATCTTTTCGGCGGCATGCGCTGTAGGCATGGCATACATTGTTTGGGGTAAATTCGGCGGCAACATCAAACGTAACGAGTGCGACGCCTTCGCCAAAGCCGAGCTCTACGACTGGATTGTGTGGGTGTTTTACATGTCCAAGTACATCGAGTTTGCCGACACCTTTTTTCTCATCATCAAAGGCGAAGGCGTCTCGTGGCTCCACTACTACCACCACATTGGCGCTGCGATTGACATGGGCATCCTCTGGAAGTCTGGTACCGAGGCGATGTGGATCTTTGTCCTCTTCAACGGGACTGTGCACACGGTCATGTACGCATATTACG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，以裂殖壶菌为生产菌株发酵生产多不饱和脂肪酸，其特征在于，在发酵培养基中添加恩西地平；其中，发酵培养基和恩西地平的用量比例为1L：1~50mmol。2.根据权利要求1所述的裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌为裂殖壶菌HX
‑
308，其保藏编号为CCTCC No.M209059。3.根据权利要求1所述的裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌是以裂殖壶菌HX
‑
308为野生型，且过表达裂殖壶菌C18延长酶基因和裂殖壶菌n3去饱和酶基因的裂殖壶菌工程菌。4.根据权利要求3所述的裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌工程菌是将克隆所得的裂殖壶菌HX
‑
308的C18延长酶基因和裂殖壶菌HX
‑
308的n3去饱和酶基因连接入pBS
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Zeo载体后，转化至裂殖壶菌HX
‑
308所得。5.根据权利要求1所述的裂殖壶菌发酵生...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，马旺，孙小曼，贾雨雷，黄鹏伟，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：