一株高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLH507，已于2021年11月12日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC NO.23786；本发明专利技术还公开了所述菌株在以木质纤维素水解液为原料发酵生产乙醇中的应用。实验证实，本发明专利技术菌株为一株兼具亲本菌株的葡萄糖/木糖共代谢能力、对混合抑制物的高耐受性及对纤维二糖及木寡糖水解能力的酿酒酵母工业菌株，且具有较强的同步糖化发酵能力，其限氧条件培养64

【技术实现步骤摘要】
一株高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及一株C6/C5共发酵酿酒酵母菌株及其应用，尤其涉及一株高鲁棒性、高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]生物燃料乙醇是典型的可再生和环境友好型能源之一，其自身特性和功能使其易于与汽油混合，是国际公认的可替代化石能源的理想液体燃料之一。以廉价且储量丰富的木质纤维素生物质，特别是秸秆等农业残留物为原料生产的第二代燃料乙醇即纤维素乙醇是目前最有产业化前景的先进燃料。纤维素乙醇生产的基本流程是物理/化学因子预处理改变木质纤维素原料结构；经纤维素酶酶解后释放单糖及寡糖；微生物(首选为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)对糖分最大限度地发酵生成乙醇；蒸馏及脱水操作后得到无水乙醇用于添加到汽油中。但在常见的预处理和酶解之后，伴随葡萄糖和木糖等单糖的释放，同时也会产生各类抑制发酵微生物生长的化合物(如弱酸类、呋喃醛类和酚类等非糖组分抑制物)及寡糖(如纤维二糖、木寡糖等)。
[0003]酿酒酵母作为乙醇发酵生产的首选微生物，具有生长速率快、公认安全及遗传操作体系完善等诸多优点，是极具潜力的细胞工厂。理想的木质纤维素水解物的乙醇发酵，要求发酵微生物，
①
能够耐受上游工艺过程中产生弱酸、呋喃醛和酚类等抑制性化合物；
②
同时尽可能实现葡萄糖、木糖等单糖以及纤维二糖、木二糖等寡糖的高效共发酵，从而降低生产成本、提高纤维素乙醇生产的经济效益。研究者经过30余年的努力，对酿酒酵母菌株的改造取得了较大成果，相关研究已取得长足进步。目前，大部分研究所构建的重组酵母工业菌株，基于消耗糖的乙醇发酵得率在0.40
‑
0.48g
·
g
‑1之间。然而，将上述重组工业菌株应用在纤维素乙醇的产业化生产中，依然存在一些不尽人意之处。尤其是菌株缺乏寡糖代谢能力，以及在含有抑制物的木质纤维素水解液中，工程菌株对糖的利用速率显著低于纯品混合糖培养基，说明抑制物对菌株的影响依然严重，且愈发凸显为纤维素乙醇产业化的一个主要障碍。
[0004]申请人在前期工作中，基于从牛瘤胃宏基因组(bovine rumen metagenomic library)中筛选得到的高活性木糖异构酶Ru
‑
XI和来自季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的特异性木糖转运蛋白MGT05196
N360F
，以野生型二倍体酿酒酵母BSIF为出发菌株，通过理性代谢工程及适应性进化工程构建得到一株葡萄糖&木糖高效共利用的重组酿酒酵母菌株LF1(专利技术专利号：ZL201510747241.7)。然而，该菌株的鲁棒性相对于工业应用仍有不足，且缺乏对寡糖的利用能力。专利《一株能够缓解木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母及其应用》(专利号ZL202011296559.5)通过常温常压等离子体(ARTP)迭代诱变，并结合在高毒性(含多种抑制物)玉米秸秆预处理液和纯木糖培养基中交替驯化和筛选获得菌株6M
‑
15，其能够缓解木糖利用与高鲁棒性间的拮抗现象，但是该菌株依然缺乏对寡糖的利用能力。针对上述问题，经信息检索，目前具备葡萄糖&木糖共利用、高
鲁棒性及寡糖利用等三价性能的酿酒酵母菌株构建和应用的相关专利和文献尚未见报道。

技术实现思路

[0005]针对目前二代燃料乙醇生产所用酿酒酵母菌株对木质纤维素水解液中所含混合抑制物的耐受性不足，以及菌株缺乏木寡糖、纤维二糖等寡糖水解能力的现状，本专利技术要解决的问题是提供一株高鲁棒性、高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株及其应用。
[0006]本专利技术所述的高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株，其特征在于：所述菌株是通过原生质体融合育种技术，结合迭代筛选及验证后获得，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLH507，菌株已于2021年11月12日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.23786；该菌株同时具备水解寡糖(木寡糖和纤维二糖)、对木质纤维素水解液中所含混合抑制物的耐受性及代谢木糖三重特性，且具有遗传稳定性。
[0007]上述高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株具有如下特征和功能：
[0008](1)菌株BLH507为二倍体菌株。
[0009](2)菌株BLH507于50mL的YPD液体培养基中培养至OD
600
为0.5时的海藻糖含量约为37mg
·
g
‑1(细胞干重)，菌株总还原力约为17GSH/GSSG。
[0010](3)菌株BLH507的木糖异构酶酶活为0.66U
·
mg
‑1蛋白；木糖苷酶酶活约为6.00U
·
mg
‑1蛋白；β
‑
葡萄糖苷酶酶活约为5.34U
·
mg
‑1蛋白。
[0011](4)菌株BLH507以0.5g
·
L
‑1细胞干重接种至40mL含2.0
×
混合抑制物的4％YPD液体培养基(即YP培养基添加40g
·
L
‑1葡萄糖)中限氧发酵时，36h可将约40g
·
L
‑1葡萄糖全部消耗完，并生成19.29g
·
L
‑1乙醇，得率为0.480。其中，所述培养基中，各抑制物组份及终浓度分别为20mM乙酸，10mM甲酸，10mM乙酰丙酸，10mM糠醛，10mM HMF，10mM香草醛。
[0012](5)菌株BLH507以0.5g
·
L
‑1细胞干重接种至40mL，4％YPX液体培养基中限氧发酵时，12h可将40g
·
L
‑1木糖全部消耗完，并生成17.8g
·
L
‑1乙醇，得率为0.446。
[0013](6)菌株BLH507在YPD液体培养基中连续传代约1000代，其上述性能基本保持稳定。
[0014](7)菌株BLH507以0.5g
·
L
‑1细胞干重接种至40mL YPGX液体培养基(即YP培养基添加40g
·
L
‑1木糖，80g
·
L
‑1葡萄糖)中进行限氧发酵时，在16h将80g
·
L
‑1葡萄糖和40g
·
L
‑1木糖全部消耗完，乙醇得率为0.476，且发酵12h时，葡萄糖完全耗尽，同时约有78％的木糖同时被利用。
[0015]上述高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株，其特征在于：所述菌株是通过原生质体融合育种技术，结合迭代筛选及验证后获得，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BLH507，菌株已于2021年11月12日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC NO.23786；该菌株同时具备水解寡糖、对木质纤维素水解液中所含混合抑制物的耐受性及代谢木糖三重特性，且具有遗传稳定性。2.权利要求1所述高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株的构建方法，步骤是：(1)通过检测海藻糖含量及总还原力指标，确定选择高鲁棒性的二倍体酿酒酵母工业菌株RC212；(2)通过同源重组分别在菌株RC212染色体上多拷贝整合β
‑
葡萄糖苷酶基因和β
‑
木糖苷酶基因，使其获得水解纤维二糖和木寡糖的能力，所得菌株命名为BLN26，做为原生质体融合亲本1；(3)选择保藏号为CGMCC No.11331的含有木糖异构酶基因且能代谢木糖的的重组酿酒酵母菌株LF1作为原生质体融合亲本2，进行原生质体制备后将亲本1与亲本2融合，初筛及复筛后获得潜在融合子；(4)具三价性能稳定融合菌株的筛选：1)将步骤(3)得到的融合子，稀释后均匀涂布于含有苯菌灵的YPXO固体筛选培养基上，30℃恒温摇床培养3
‑
5天；其中，所述含有苯菌灵的YPXO固体筛选培养基是指YPXO培养基中含有30ng/uL苯菌灵，YPXO培养基配方是：YP培养基添加20g
·
L
‑1低聚木糖；2)挑取生长较好的单菌落，至含1.5
×
混合抑制物及10ng
·
μL
‑1苯菌灵的YPX液体培养基中，于Bioscreen全自动生长曲线分析仪中培养3
‑
4天，挑取生长较好的孔板对应的菌落进行PCR及发酵性能验证；其中，所述培养基中，各抑制物组份及终浓度分别为15mM乙酸，7.5mM甲酸，7.5mM乙酰丙酸，7.5mM糠醛，7.5mM HMF，7.5mM香草醛；YPX液体培养基配方是：YP培养基添加20g
·
L
‑1木糖；3)通过酵母菌落PCR验证，选择同时具有木糖异构酶基因、β
‑
葡萄糖苷酶基因和β
‑
木糖苷酶基因三种特...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍晓明，李洪兴，吴龙昊，颜凝，杨硕，李在禄，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：