蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法技术

本发明专利技术提供了一种蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，属于食品安全检测技术领域。本发明专利技术针对目前采用高效液相法基质干扰大，灵敏度低，检出限高等问题，无法满足蜂蜜这类基质复杂样品对该类化合物检测的要求。本发明专利技术中采用乙酸乙酯提取蜂蜜中雷公藤甲素，经N

【技术实现步骤摘要】
蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法


[0001]本专利技术属于食品安全检测


技术介绍

[0002]GB 14963
‑
2011《食品安全国家标准蜂蜜》中明确指出，蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露应安全无毒，不得来源于雷公藤、博落回等有毒蜜源植物。然而，近几年食用蜂蜜中毒事件仍频有发生，且多数为有毒蜜源植物雷公藤。因此，迫切需要制定蜂蜜中雷公藤甲素的补充检验方法，提高蜂蜜的食品安全监管靶向性，提早发现问题和风险，以避免雷公藤毒蜜源中毒事件再次发生。
[0003]目前国内还没有关于蜂蜜中雷公藤甲素的检测方法标准，而且只有极少几篇对雷公藤甲素检测方法的报道。对蜂蜜中雷公藤甲素的测定主要为高效液相法(HPLC)和超高效液相色谱法等方法，上述方法存在基质干扰大，灵敏度低，检出限高等问题，无法满足蜂蜜这类基质复杂样品对该类化合物检测的要求。
[0004]液相色谱
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串联质谱法(LC
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MS/MS)作为目前报道较多的方法，其具有专属性强，分辨率高的特点，山东农业大学硕士论文《雷公藤甲素和雷公藤红素在蜂蜜中的含量测定及其降解特征研究》公开了一种蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，但是其前处理步骤需要加入磁性纳米颗粒，在外加磁场下进行富集，才能结合液相色谱
‑
串联质谱法检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是，提出一种蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，方法更加简单，蜂蜜中雷公藤甲素(雷公藤内酯醇)经乙酸乙酯提取，N
‑/>丙基乙二胺固相萃取柱净化，用液相色谱
‑
串联质谱测定，外标法定量。
[0006]本专利技术中所采用的测定方法具体步骤如下：
[0007]1)试样的制备与保存：对无结晶的蜂蜜样品将其搅拌均匀。对有结晶析出的蜂蜜样品，在密闭情况下，将样品瓶置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，在融化时必须注意防止水分挥发。装入洁净容器，密封，标明标记。
[0008]2)试样的提取：称取蜂蜜试样2.000g置于50mL离心管中，加入4mL水与蜂蜜充分混匀，加入乙酸乙酯15mL，经涡旋震荡和超声处理后，离心分离取上清液，沉淀再加入乙酸乙酯15mL，重复提取1次，合并上清液，旋转蒸发至干。
[0009]3)试样的净化：残渣用2mL乙酸乙酯溶解，过N
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丙基乙二胺固相萃取柱，用乙酸乙酯5ml洗脱，收集洗脱液，氮气吹干。准确量取甲醇溶液1mL溶解残余物，经0.22μm微孔滤膜过滤，供液相色谱
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串联质谱测定。
[0010]5)系列基质标准工作溶液的制备：准确量取雷公藤甲素标准中间液，用空白样品提取液溶解稀释，配制成雷公藤甲素的系列基质标准工作溶液；
[0011]所述的雷公藤甲素标准中间液为1μg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液，配制方法如下：
[0012]准确量取雷公藤甲素标准储备液100μL，置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，
摇匀，制成质量浓度为1μg/mL的雷公藤甲素标准中间液。
[0013]所述的雷公藤甲素标准储备液为1mg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液，配制方法如下：
[0014]准确称取雷公藤甲素标准品20.0mg于10mL烧杯中，用甲醇溶解后转移到20mL容量瓶中，并用甲醇定容。
[0015]空白样品提取液，不加试样重复步骤2)和步骤3)获得。
[0016]6)液相色谱
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串联质谱测定
[0017]A、液相色谱条件：色谱柱：C18柱，柱长75mm以上，粒径2.7μm；流动相：A为0.1wt％的甲酸溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序如下：0～4min 90％A和10％B，4～6min 5％A和95％B，6～7min 3％A和97％B，7～10min 90％A和10％B；流速：300μL/min；柱温：室温；进样量：5μL。
[0018]B、质谱参考条件：离子源：电喷雾离子源(ESI)；检测方式：多反应模式(MRM)；扫描方式：正离子模式扫描(ESI+)；电喷雾电压(IS)：5500V；气帘气(CUR)：20L/min；雾化气压力(GS1)：55L/min；辅助气压力(GS2)：40L/min；离子源温度(TEM)：500℃。定性离子对为361.1/141.2或361.1/104.9、定量离子对为361.1/128.0、去簇电压(DP)100V、碰撞能量(CE)定量测定为80eV、定性测定为80或60eV、碰撞室入口电压(EP)10V、碰撞室出口电压(CXP)13V。
[0019]C、定性测定
[0020]通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准色谱峰的特征离子相对照定性；雷公藤甲素的参考保留时间为4.81min，试样与标准品保留时间的相对偏差不大于2.5％；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，允许的偏差如下：
[0021]相对离子丰度>50时，允许的相对偏差为
±
20；相对离子丰度20～50时，允许的相对偏差
±
25；相对离子丰度10～20时，允许的相对偏差
±
30；相对离子丰度≤10时，允许的相对偏差
±
50；
[0022]D、定量测定
[0023]按上述条件设定仪器条件，以基质标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制基质标准工作曲线，按外标法计算试样中雷公藤甲素的含量；样品中雷公藤甲素质量浓度应在标准工作曲线质量浓度范围内，超出标准工作曲线质量浓度上限的样品应稀释后进样。
[0024]E、空白试验
[0025]用空白样品提取液进样，均按试样同法操作。
[0026]7)结果计算
[0027]结果按式(1)计算：
[0028][0029]式(1)中：
[0030]X—试样中各待测组分的含量，μg/kg；
[0031]C—从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，ng/mL；
[0032]V—试样溶液最终定容体积，mL；
[0033]f—试样制备过程中的稀释倍数；
[0034]m—试样质量，g。
[0035]计算结果需扣除空白值，测定结果用2次平行测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。
[0036]优选的，步骤2)中涡旋震荡5min，超声10min，以10000r/min离心5min。
[0037]优选的，步骤3)中甲醇溶液中甲醇和水体积比为1:1。
[0038]本专利技术的有益效果：
[0039]本专利技术方法具有专属性强，分辨率高的特点，可以进行蜂蜜中雷公藤甲素的定性、定量检测。
附图说明
[0040]图1雷公藤甲素定量离子对质量色谱图(m/z 361.1/128.0)；
[0041]图2雷公藤甲素定性离子对质量色谱图(m/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，其特征在于，该方法的步骤如下：1)试样的制备与保存：对无结晶的蜂蜜样品将其搅拌均匀；对有结晶析出的蜂蜜样品，在密闭情况下，将样品瓶置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，在融化时必须注意防止水分挥发；装入洁净容器，密封，标明标记；2)试样的提取：称取蜂蜜试样2.000g置于50mL离心管中，加入4mL水与蜂蜜充分混匀，加入乙酸乙酯15mL，经涡旋震荡和超声处理后，离心分离取上清液，沉淀再加入乙酸乙酯15mL，重复提取1次，合并上清液，旋转蒸发至干；3)试样的净化：残渣用2mL乙酸乙酯溶解，过N
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丙基乙二胺固相萃取柱，用乙酸乙酯5ml洗脱，收集洗脱液，氮气吹干；准确量取甲醇溶液1mL溶解残余物，经0.22μm微孔滤膜过滤，供液相色谱
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串联质谱测定；5)系列基质标准工作溶液的制备：准确量取雷公藤甲素标准中间液，用空白样品提取液溶解稀释，配制成雷公藤甲素的系列基质标准工作溶液；所述的雷公藤甲素标准中间液为1μg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液；所述的空白样品提取液，不加试样重复步骤2)和步骤3)获得；6)液相色谱
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串联质谱测定A、液相色谱条件：色谱柱：C18柱，柱长75mm以上，粒径2.7μm；流动相：A为0.1wt％的甲酸溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序如下：0～4min 90％A和10％B，4～6min 5％A和95％B，6～7min 3％A和97％B，7～10min 90％A和10％B；流速：300μL/min；柱温：室温；进样量：5μL；B、质谱参考条件：离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应模式；扫描方式：正离子模式扫描；电喷雾电压：5500V；气帘气：20L/min；雾化气压力：55L/min；辅助气压力：40L/min；离子源温度：500℃；定性离子对为361.1/141.2或361.1/104.9、定量离子对为361.1/128.0、去簇电压100V、碰撞能量定量测定为80eV、定性测定为80或60eV、碰撞室入口电压10V、碰撞室出口电压13V；C、定性测定通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹彧，马彧，刘丽，李正刚，温铁岩，韩凤，
申请(专利权)人：四平市食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：