基于Cardipy染料的溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于分析化学领域，涉及溶酶体靶向荧光探针的设计，特别是指基于Cardipy染料的溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用。该探针结构式如下：。荧光强度随着pH降低逐渐增强，在pH=4

【技术实现步骤摘要】
基于Cardipy染料的溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分析化学领域，涉及溶酶体靶向荧光探针的设计，特别是指基于Cardipy染料的溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]溶酶体作为一种酸性细胞器（pH 4.5
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5.5）在很多的生理过程中发挥着重要的角色。其内部含有50多种酸性水解酶，这些水解酶在酸性条件下被激活，将细胞中的生物大分子降解为小分子，然后从溶酶体中输出，用于生物合成的重新利用，以维持细胞内生命活动的正常运转。除此以外，溶酶体还可以在水解酶的协助下清除受细胞内受损伤的细胞器，蛋白质以及核酸。然而，溶酶体内pH的失衡会导致酸性水解酶的活性降低及溶酶体的功能受损，从而引起细胞内生理过程及生命活动的紊乱，进而导致脂质贮积症等一系列溶酶体相关疾病的产生。因此，开发有效的工具用来监测溶酶体内pH的波动是必要的。
[0003]小分子荧光探针呈现出高的选择性和灵敏性、实时监测以及响应快的优势而被广泛地用于对细胞内的微环境、生物分子、氨基酸等进行传感及成像。基于溶酶体弱酸性的特性，很多溶酶体靶向型的探针被开发。但是大多数溶酶体探针都是通过在分子结构中引入吗啡啉、二甲氨基、二乙胺基等弱碱性的脂肪胺基团实现溶酶体的靶向性的。这些弱碱性基团的引入会消耗溶酶体中的质子，引起溶酶体内部pH的升高，降低酸性水解酶的活性，导致溶酶体功能受损。目前，迫切需要开发新型的不依赖弱碱性胺为pH响应位点的新型的溶酶体靶向荧光探针。
[0004]通过酚羟基保护与脱保护，激活型荧光探针被广泛的应用于生物体内的传感与成像。基于酚负离子具有强的供电子能力，能够在荧光探针内作为强供电子基团，形成有效的分子内电荷转移作用，从而显示强的荧光。当以酚羟基或者被酯类等基团保护住后，酚羟基的供电子能力较弱，不能形成有效的分子内电荷转移作用，从而显示较短的吸收和发射波长以及弱的荧光。从而实现对活性物质的识别传感。但是基于酚羟基保护和脱保护类型的探针在用到溶酶体成像时存在着巨大的挑战。这是因为常见的酚羟基类型的探针在弱酸性条件下没有荧光，在中性或弱碱性条件下显示强的荧光，当该类型探针进入溶酶体后，会导致荧光猝灭，从而无法对溶酶体进行有效的监测。因此，开发基于酚羟基的细胞溶酶体靶向的荧光增强型探针具有重大意义，也具有非常大的挑战。

技术实现思路

[0005]为实现上述目的，本专利技术提出一种基于Cardipy染料的溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：基于Cardipy染料的溶酶体靶向荧光探针，其结构式如下：
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[0007]上述的溶酶体靶向荧光探针的制备方法，技术路线如图1所示，步骤为：（1）将2,4
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二甲基吡咯和氢氧化钾溶解于干燥的DMSO中，在氮气流保护下室温搅拌后加入二氯甲烷在继续搅拌得到白色固体即化合物2；（2）向化合物2的甲苯溶液中加入三光气所得混合溶液回流5 h，经快速柱色谱分离混合物得白色固体3；（3）将化合物3的无水THF溶液加入到邻甲基溴苯和正丁基锂的混合溶液中反应，反应溶液经纯化后得化合物4；（4）化合物4在冰醋酸与哌啶催化下进一步与对羟基苯甲醛反应，反应结束后除去有机溶剂后将剩余的物质溶解在HCl和THF的1:1混合物中进行阴离子交换，所得混合溶液的有机层经萃取、干燥蒸发、纯化得到红色固体。
[0008]优选的，所述步骤（1）中2,4
‑
二甲基吡咯、氢氧化钾和二氯甲烷的物质的量比为2:3:1.5。
[0009]优选的，所述步骤（2）中化合物2和三光气的物质的量比为5:2。
[0010]优选的，所述步骤（3）中化合物3、邻甲基溴苯和正丁基锂的物质的量比为0.3:1:1。
[0011]优选的，所述步骤（4）中化合物4和对羟基苯甲醛的物质的量比为1:3。
[0012]上述的荧光探针在非疾病诊断目的的可视化检测溶酶体中的应用。
[0013]上述的荧光探针在非疾病诊断目的的监测活细胞中溶酶体内pH波动中的应用。
[0014]上述的荧光探针在非疾病诊断目的的可视化监测伤口中的应用。
[0015]上述应用的机理路线为：。
[0016]上述的应用步骤为：将2 μM探针和LysoTracker
TM Deep Red共同孵育待测细胞15
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20min，通过激光共聚焦成像观测探针在待测细胞中的分布。
[0017]上述的应用步骤为：将2 μM探针与待测细胞共同孵育15
‑
20min，通过激光共聚焦
成像观测探针荧光强度的变化。
[0018]进一步的，上述2 μM探针的配制方法为：（1）称取一定质量的探针，溶解在乙腈中，配制成2 mM的探针储备液；（2）分别称取7.8395 g磷酸、4.8040 g乙酸、4.9440 g硼酸配置不同pH（2
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12）的B
‑
R溶液；（3）分别取2 mL步骤（2）中配置的不同pH（2
‑
12）的B
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R溶液于荧光比色皿中，加入2 μL步骤（1）中配置的探针储备液，使其终浓度为2 μM，在575 nm的激发下，测量不同pH条件下的荧光强度；（4）将2 μL步骤（1）中配置的探针储备液稀释在2 mL pH分别为4、6和8的溶液中，使其终浓度为2 μM，激发波长为575 nm。
[0019]本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术以具有吸电子基团的carbon
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dipyrromethene（Cardipy）荧光染料为母核，通过引入对羟基苯甲醛设计并合成了具有溶酶体靶向能力且对pH敏感的小分子荧光探针。在中性或弱碱性环境中，探针失去质子以酚氧负离子的形式存在，酚氧负离子强的供电子能力与具有强吸电子的Cardipy母核形成有效的扭曲的分子内电荷转移作用，导致连接Cardipy母核和苯酚的C=C双键旋转，从而其荧光猝灭。在酸性的溶酶体中，酚氧负离子被质子化生成供电子能力较弱的酚羟基，从而抑制了C=C键的旋转，释放出强的荧光。基于探针对溶液酸性的敏感性，通过荧光强度的变化可以实时动态监测溶酶体内pH的波动。另外，结合伤口处组织液的酸性环境及探针对pH敏感的特性，探针在伤口处呈现出明亮的荧光信号，从而实现伤口可视化。
[0020]2、本专利技术提供的探针含有酚羟基因此和正电荷具有较好的水溶性、在激发波长为575 nm的条件下，探针分别在pH为4、6和8的溶液中于610 nm处的荧光强度随着光照时间的延长基本保持不变，持续光照30分钟后，仍然有超过93%、95% 和70%荧光的保留，表明，探针在酸性、弱酸性和碱性环境中均具有较好的光稳定性，可以用于生物体内长时间成像。
[0021]3、本专利技术提供的探针生物相容性好和组织渗透性强。MTT实验证明在探针溶度达到20 μM时HeLa细胞仍然有超过95%的存活率，表明探针具有较好的生物相容性；红光发射赋予本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于Cardipy染料的溶酶体靶向荧光探针，其结构式如下：。2.权利要求1所述的溶酶体靶向荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤为：（1）将2,4
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二甲基吡咯和氢氧化钾溶解于干燥的DMSO中，在氮气流保护下室温搅拌后加入二氯甲烷在继续搅拌得到白色固体即化合物2；（2）向化合物2的甲苯溶液中加入三光气所得混合溶液回流5 h，经快速柱色谱分离混合物得白色固体3；（3）将化合物3的无水THF溶液加入到邻甲基溴苯和正丁基锂的混合溶液中反应，反应溶液经纯化后得化合物4；（4）化合物4在冰醋酸与哌啶催化下进一步与对羟基苯甲醛反应，反应结束后除去有机溶剂后将剩余的物质溶解在HCl和THF的1:1混合物中进行阴离子交换，所得混合溶液的有机层经萃取、干燥蒸发、纯化得到红色固体。3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中2,4
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二甲基吡咯、氢氧化钾和二氯甲烷的物质的量比为2:3:1.5。4.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙远强，孙朋娟，李朝辉，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：