2019-新冠状病毒N蛋白单域抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了2019

【技术实现步骤摘要】
2019-新冠状病毒N蛋白单域抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及单域抗体，尤其涉及抗2019-新型冠病毒N蛋白的单域抗体以及用该单域抗体与IgG-Fc构建得到的融合蛋白，本专利技术还涉及它们在检测新型冠病毒N蛋白或治疗由新型冠病毒所导致疾病的药物中的应用，属于抗新型冠病毒单域抗体及其应用领域。

技术介绍

[0002]2019新型冠狀病毒(2019Novel coronavirus，简称2019-nCoV或2019新冠病毒或SARS-CoV2)的传播主要通过呼吸道系统，病灶主要是肺部，称为“新型冠状病毒肺炎”，简称“新冠肺炎”(Novel coronavirus pneumonia,NCP or COVID-19)。冠状病毒属于套式病毒目，冠状病毒科，分为四个属：甲型、乙型、丙型、丁型。在乙型里面又分为四个亚型，包括A亚型、B亚型、C亚型和D亚型。目前大家知道的甲型里有两个病毒，229E和NL63，在B亚型里有OC43和HKU1，这四个人类冠状病毒可以感染人，但引起的症状很轻，像感冒一样，所以并没有引起人们重视。直到2003年的SARS冠状病毒，2012年的MERS冠状病毒，和今年的新冠病毒出现以后，它们的高传染性、高致死率才引起了人们的高度重视。
[0003]2019-nCoV是一类新发现的单股正链RNA冠状病毒。新冠病毒粒子外包脂质双层膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(S，Spike Protein，是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基(subunit)，即S1和S2，其中S1主要包含有受体结合区(receptor binding domain,RBD)，负责识别细胞的受体(angiotensin-converting enzyme 2,AEC2)；S2含有膜融合过程所需的基本元件，S蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点；小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein，较小，与包膜结合的蛋白)；膜糖蛋白(M，Membrane Protein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。病毒核衣壳内最重要的蛋白之一核衣壳蛋白(N蛋白)，是冠状病毒中含量最丰富的蛋白，在病毒体组装过程中，其与病毒RNA结合而使螺旋核衣壳形成。N蛋白是一种高度免疫原性的磷蛋白，与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。
[0004]上世纪九十年代初，比利时自由大学免疫研究所所长Raymond Hamers教授领导的抗体研究组，在辅导医学院学生的实习实验研究中，发现了一种在骆驼血液中自然存在，功能全，仅有重链的抗体。经过后续深入研究，仅一个重链抗体的可变区，称为单域抗体(single domain antibody),由于其仅有2-5nm大小，又称纳米抗体(nanobody)。这种来源于骆驼重链抗体可变区的纳米抗体(VhH)，其分子量(15Kd)只有普通抗体分子量的十分之一，具有普通抗体和其它单价小分子抗体无可比拟的独特性质和优点。单域抗体技术也已成熟，Ablynx公司的抗急性血栓单域抗体药物已在欧美上市，还有多个药物在临床前和临床期研究。
[0005]现代最常用的病原体快速检测技术主要是两大类，一类是核酸的检测，另一类是抗原抗体的检测。核酸(DNA或RNA)是病毒的遗传物质，任何物种都有其独一无二的核酸序列，那么对它特征序列的检测即可确定病原体。抗原是能激发人免疫反应产生抗体的任何
物质，比如病毒的特征蛋白质是抗原，而人体免疫系统产生用来专门对抗该抗原的另外一种蛋白质(免疫球蛋白)就是它对应的抗体。这一组抗原抗体可以特异性相互结合的特性可以作为检测的理论基础。
[0006]目前核酸检测主要方法有测序、PCR、等温扩增及CRISPR技术等。抗原抗体的检测方法主要有胶体金免疫层析、ELISA和免疫化学发光技术等。核酸检测作为SARS-CoV2临床诊断的金标准，但也存在检测时间长、检出率低、需要专门设备、需要培训专业检测人员、检测费用相对较高等缺陷。
[0007]由于1个病毒颗粒只含有1条RNA，而病毒颗粒外面含有3000多个N蛋白分子，当核酸检测灵敏度为200-1000拷贝/ml，开发检测病毒N蛋白抗原的检测方法是可行的。因此，应用单域抗体技术平台，筛选SARS-CoV2的N蛋白特异性单域抗体，这对于SARS-CoV2的N蛋白快速检测具有重要的价值。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的之一是提供抗2019-新型冠病毒N蛋白的单域抗体及其编码基因；
[0009]本专利技术的目的之二是将所述的单域抗体与IgG1-Fc融合得到融合蛋白；
[0010]本专利技术的目的之三将所述的抗2019-新型冠病毒N蛋白的单域抗体以及单域抗体与IgG1-Fc融合得到融合蛋白应用于制备检测新型冠病毒N蛋白的试剂或制备治疗由新型冠病毒所导致的疾病的药物；
[0011]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0012]本专利技术首先提供了抗2019-新型冠病毒N蛋白的单域抗体，所述单域抗体均包括3个互补决定区，所述单域抗体选自所述单域抗体选自N2-8或N2-10；其中，单域抗体N2-8的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；单域抗体N2-10的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；或者将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或者与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列。
[0013]作为本专利技术一种优选的具体实施方式，单域抗体N2-8的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示，单域抗体N2-10的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示；或者将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或者与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列。
[0014]本专利技术进一步提供了所述单域抗体的编码基因；优选的，所述单域抗体N2-8的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，所述单域抗体N2-10的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示；或者与上述所示的任何一种多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或者与上述所示的任何一种的多核苷酸序列至少有90％以上同一性的多核苷酸序列。
[0015]本专利技术更进一步提供了重组表达载体，所述重组表达载体包含所述抗新型冠病毒N蛋白的单域抗体或人源化单域抗体的编码基因；优选的，所述重组表达载体为原核细胞表达载体或真核细胞表达载体。
[0016]本专利技术还提供了重组宿主细胞，其包含上面所述的重组表达载体。优选的，所述的重组宿主细胞为重组原核表达细胞、重组真核表达细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗2019-新冠状病毒N蛋白的单域抗体，所述单域抗体均由框架区和3个互补决定区组成，其特征在于，所述单域抗体选自N2-8或N2-10；其中，单域抗体N2-8的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；单域抗体N2-10的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；或者将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或者与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列。2.按照权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，单域抗体N2-8的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示，单域抗体N2-10的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示；或者将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或者与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列。3.权利要求1或2任何一项所述单域抗体的编码基因；优选的，所述单域抗体N2-8的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，所述单域抗体N2-10的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示；或者与上述所示的任何一种多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或者与上述所示的任何一种的多核苷酸序列至少有90％以上同一性的多核苷酸序列。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求3所述的编码基因中的一个或多个。5.一种融合蛋白，其特征在于，将权利要求1或2任...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶青，程晓东，许莎莎，
申请(专利权)人：北京纽安博新逸生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：