单细胞染色体的制片方法技术

本发明专利技术提供一种单细胞染色体的制片方法，所述单细胞染色体的制片方法至少包括：向单细胞中加入DNA合成抑制剂使得其有丝分裂停止，孵育；低渗透处理：向单细胞中加入低渗溶液，静置15～30min；细胞固定：向单细胞中加入固定剂，静置；制片、烤片；染色。采用本发明专利技术所述的制备方法更加简单，获得的制片更加的清晰。获得的制片更加的清晰。

【技术实现步骤摘要】
单细胞染色体的制片方法


[0001]本专利技术涉及一种单细胞染色体的制片方法，属于细胞制片领域。

技术介绍

[0002]染色体是基因的载体，染色体核型是某一物种所特有的一组染色体或一套染色体的形态特征，通过对染色体数目的技术和对结构的观察、分析，为染色体病、遗传病、重现性遗传学异常的血液肿瘤等疾病的诊断提供形态学依据，对于肿瘤患者疗效评估、预后判断具有重要的临床意义。
[0003]对染色体的观察的方法主要是由1968年瑞典Casperson建立，将中期染色体经预处理，再用不同的方法染色，使染色体上出现明显而稳定的斑带。主要分为两大类：一类是染色带分布整个染色体上，如G、Q、R带；另一类是局部的显带，使少数特定的区域显带，如C、T和N带。本检测方案主要采用的是G带分析，是最常用的分带技术，特点是非常稳定。
[0004]骨髓是人体的重要的造血组织。成年人的骨髓分两种：红骨髓和黄骨髓。红骨髓能制造红细胞、血小板和各种白细胞。单细胞中有丝分裂指数较高，因此可以直接得到中期细胞，因此，仅仅给一定剂量的秋水仙碱即可以使得许多出于分裂状态细胞被阻断在有丝分裂中期。
[0005]染色体标本制备是染色体核型分析过程中最重要的技术，也是临床遗传学诊断中常用检测方法之一。稳定获得足量中期分裂相、显带清晰、形态较好的染色体，有以下关键因素必须兼顾：(1)染色体的分布情况：在显微镜下观察，染色体之间如果出现交叉、重叠等未分散开的情况，会影响核型的判断和分析；(2)染色体的条带：如果染色体条带不好，如条带模糊不清，条带有染色过深或过浅，均影响异常结果的判读，甚至无法判断。
[0006]传统的单细胞染色体标本制作方法主要包括以下步骤：取材、秋水仙碱阻断细胞分裂、低渗处理使得染色体分散、预固定、细胞固定、制片以及镜检。预固定主要作用是为了终止低细胞收获过程中，固定的次数和时间会影响染色体的收获效果。预固定液的用量最终影响染色体分散质量，随着预固定液浓度升高，细胞越容易成团，制片过程中较难分开，染色体易聚积，制片效果较差。如果低渗时间较长，易造成细胞破裂，染色体从细胞区域漏出，造成丢失。
[0007]但是以上方法较为复杂，尤其是对于预固定液的用量和时间的掌控，如果处理不当将会严重影响制片的质量。

技术实现思路

[0008]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种单细胞染色体的制片方法，用于解决现有技术中的制片方法较为难以掌控，制片结果不理想的问题。
[0009]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种单细胞染色体的制片方法，所述方法包括以下步骤：
[0010](1)向单细胞中加入DNA合成抑制剂使得其有丝分裂停止，孵育。
[0011]单细胞可以来自人体的任何部位的骨髓系细胞。
[0012]进一步地，所述单细胞是经过培养后的细胞。
[0013]优选地，所述单细胞来自确诊患者、未确诊患者或者被怀疑患有某种疾病的患者。
[0014]优选地，单细胞来自未确诊患者时或者被怀疑患有某种疾病的患者时，使用的培养液A、培养时间20～48h。同时为了避免假阳性或假阴性可以制备同时制备对照组，采用加刺激剂的培养液A(即C培养液)。
[0015]优选地，所述单细胞来自B细胞淋巴瘤时，使用培养液A，培养时间70～74h。进一步地，为了避免假阳性或假阴性可以制备同时制备对照组，采用加脂多糖(LPS)的培养液A。
[0016]优选地，来自T细胞淋巴瘤时，使用的培养液选用A培养液，培养时间70～74h。进一步地，为了避免假阳性或假阴性可以制备同时制备对照组，采用加入了植物血球凝集素(PHA)的A培养液。
[0017]进一步地，上述A培养液可以是：1640培养液：小牛血清：青链霉素＝500：150：7(体积比)。
[0018]进一步地，上述C培养液可以是1640培养液：小牛血清：青链霉素：重组人体粒细胞刺激因子＝500：150：7：0.15(体积比)。
[0019]进一步地，所述DNA合成抑制剂选自秋水仙酰胺、秋水仙碱中的任意一种或几种。在优选的方案中采用秋水仙酰胺，两者功效相同，但是秋水仙酰胺毒性大大降低。
[0020]进一步地，所述DNA合成抑制剂加入的量为80～100微升。
[0021]进一步地，所述孵育的条件是：36～38℃、20～40min；优选为37℃。
[0022]此步处理主要目的是使细胞分裂相保持在中期，便于后期的形态观察。
[0023](2)低渗透处理：向单细胞中加入低渗溶液，静置15～30min。
[0024]进一步地，所述低渗溶液的溶质选自KCl(氯化钾)溶液、所述溶液的浓度是0.07～0.08mol/L，更优选为0.075mol/L。所述KCL溶液是指KCl水溶液。
[0025]具体的处理方法包括：将步骤(1)中孵育后的单细胞离心1200～1500r/min，离心5～10min。弃上清液，拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀，并涡旋震荡，加入8～12ml的KCl低渗液，混匀，静置15～30min。更优选地为20min.。主要目的是使染色体分散，铺展开，便于后期观察。
[0026]进一步地，将低渗溶液预热至37℃后将单细胞和DNA合成抑制剂混合。
[0027]更优选地，低渗溶液前半部分缓慢加入，后半部分逐渐加快速度加入。所述缓慢加入是指一滴一滴加入的方式加入。
[0028](3)细胞固定：向低渗处理过的单细胞直接中加入固定剂。
[0029]在现有技术中需要将在低渗处理后的单细胞中进行预固定，而本申请中的技术方案中无需进行预固定。
[0030]进一步地，所述固定剂选用甲醇和冰醋酸的混合溶液，进一步地，所述甲醇和冰醋酸溶液体积比3:1。
[0031]进一步地，所述固定剂分三次加入，每次加入固定剂后静置。
[0032]具体方法包括：将静置后的单细胞，1200～1500r/min，离心5～10min，弃上清液，拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀，并涡旋震荡，加入的固定剂，混匀，室温静置15～20min后，1200～1500r/min，离心5～10min，弃上清液，拨动试管底部将沉积底部的细胞混
匀，并涡旋震荡，加入的固定剂，混匀，室温静置10～15min后；1200～1500r/min，离心5～10min，弃上清液，拨动试管底部将沉积底部的细胞混匀，并涡旋震荡，加入的固定剂，混匀，室温静置10～15min后，1200～1500r/min，离心5～8min。细胞收完后，放入4℃
‑
8℃冰箱中保存。
[0033]优选地，第一次加入固定剂的量为8～12ml，优选地为10ml。更优选地，固定剂的前半部分一滴一滴缓慢加入，后半部分逐渐加快速度加入。
[0034]优选地，第2次以及第3次加入的固定剂的量都为3～7ml，更优选地为5ml。
[0035](4)制片、烤片。
[0036]所述制片采用划片的方式。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单细胞染色体的制片方法，其特征在于，所述单细胞染色体的制片方法至少包括：(1)向单细胞中加入DNA合成抑制剂使得其有丝分裂停止，孵育；(2)低渗处理：向单细胞中加入低渗溶液，静置15～30min；(3)细胞固定：向低渗处理过的单细胞中直接加入固定剂，静置；(4)制片、烤片；(5)染色。2.根据权利要求1所述的单细胞染色体的制片方法，其特征在于：所述DNA合成抑制剂选自秋水仙酰胺、秋水仙碱中的任意一种或几种。3.根据权利要求1所述的单细胞染色体的制片方法，其特征在于：所述DNA合成抑制剂加入的量为80～100微升。4.根据权利要求1所述的单细胞染色体的制片方法，其特征在于：所述低渗溶为KCl溶液。5.根据权利要求1所述的单细胞染色体...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洋，
申请(专利权)人：湖北欣立达科技有限公司，
类型：发明
国别省市：