一种制备重组人奥克纤溶酶的方法技术

本发明专利技术提供了一种制备重组人奥克纤溶酶的方法，属于生物医药技术领域。该方法包括以下步骤：(1)制备酶切后的葡激酶：取重组葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到酶切后的葡激酶；其中，酶切后的葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；(2)制备重组纤溶酶：在重组纤溶酶原中加入酶切后的葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到重组纤溶酶。本发明专利技术首次发现利用上述方法能够有效去除重组纤溶酶中的杂质A，提高了重组克纤溶酶的纯度，排除了药品在临床应用中潜在的稳定性和安全性风险。本发明专利技术的方法成本较低，操作简单，适合工业化生产。适合工业化生产。适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种制备重组人奥克纤溶酶的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种制备重组人奥克纤溶酶的方法。

技术介绍

[0002]人体内的血栓常引发严重的心血管疾病，此类疾病发病突然，死亡率极高，溶栓治疗是治疗此类疾病的常用手段。人纤溶酶原是人体纤溶系统的关键成份之一。利用纤溶酶原激活剂将人纤溶酶原活化后得到的纤溶酶具有丝氨酸蛋白酶活性，能够降解包括层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白等在内的多种蛋白。研究发现，纤溶酶能够通过水解玻璃体后膜和视网膜基底膜之间的粘附分子，使玻璃体和视网膜分离，达到治疗玻璃体黄斑粘连和黄斑牵引的目的。
[0003]人纤溶酶由791个氨基酸组成，分子量约为88kD，形成两条链，重链和轻链之间以二硫键连接。人奥克纤溶酶(Ocriplasmin)作为只保留酶活性片段的重组丝氨酸蛋白酶类的纤溶酶，能够通过诱导玻璃体液化及减弱玻璃体黄斑粘连，起到药物性玻璃体后脱离的作用，避免了手术完成玻璃体后脱离创伤大、脱离不彻底等缺陷。重组人奥克纤溶酶具有纤溶酶的蛋白水解催化活性，并且比人纤溶酶更加稳定。<br/>[0004]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备重组纤溶酶的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(1)制备酶切后的葡激酶：取重组葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到酶切后的葡激酶；其中，酶切后的葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；(2)制备重组纤溶酶：在重组纤溶酶原中加入酶切后的葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到重组纤溶酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述重组葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述酶切时采用的酶切试剂为肠激酶，酶切的温度为20～26℃，时间为14～20小时。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述分离纯化的方法为：(1.1)将酶切物上样到NI亲和层析柱，用平衡缓冲液冲洗，收集含有酶切后的葡激酶的流穿液；其中，NI亲和层析柱的填料为NI Bestarose 6FF；平衡缓冲液为pH＝5.5的50mM碳酸盐缓冲液；(1.2)将步骤(1.1)收集的流穿液上样到阳离子层析柱，用洗脱剂洗脱，收集含有酶切后的葡激酶的洗脱液；其中，阳离子层析柱的填料为UniGel 50SP；洗脱的方式为梯度洗脱；洗脱剂由缓冲液A和缓冲液B组成，其中缓冲液B的浓度从0％增加到100％；缓冲液A为10mM碳酸盐缓冲液，pH＝5.5；缓冲液B为含10mM碳酸盐和0.5M NaCl的溶液，pH＝5.5；(1.3)将步骤(1.2)收集的洗脱液上样到混合模式层析柱，用平衡缓冲液冲洗，收集含有酶切后的葡激酶的流穿液；其中，混合模式层析柱的填料为Bestarose Diamond MIX
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A；平衡缓冲液为pH＝5.4的10mM碳酸盐缓冲液。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述重组纤溶酶原与酶切后的葡激酶的质量比为1:(100～140)；所述酶切的温度为20～26℃，时间为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭红卫，李宁，
申请(专利权)人：上海景泽生物技术有限公司成都景泽生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：