一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法技术

本发明专利技术公开了一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法，该方法利用大豆疫霉菌接种野生大豆叶片，筛选出抗疫霉根腐病的野生大豆，然后利用筛选出的具有抗疫霉根腐病的野生大豆与栽培大豆进行杂交，获杂交后代，对杂交后代的自交系进行抗疫霉根腐病筛选，同时结合农艺性状筛选，创制出抗疫霉根腐病的新种质，本发明专利技术利用叶片接种法筛选野生大豆抗源，克服了由于野生大豆茎细弱、易断，易导致无法准确描述实验材料抗感反应的问题，本发明专利技术通过接种后叶片变黄、变褐或失绿来了解野生大豆资源对疫霉根腐病的抗感反应，通过计算感病率来确定一个准确划分疫霉根腐病抗性级别的评价标准，从而实现准确筛选抗性资源和后代材料，大大增强了筛选的可靠性。筛选的可靠性。筛选的可靠性。

【技术实现步骤摘要】
一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法


[0001]本专利技术属于野生植物资源利用研究领域，特别涉及一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法。

技术介绍

[0002]大豆疫霉根腐病(Phytophthora root rot,PRR)最早是在美国俄亥俄州和印第安纳州发现的，随后在澳大利亚、阿根廷、匈牙利、巴西、中国、日本、加拿大和韩国等国家的大豆生产区都有发生，现已成为主要的世界性大豆病害。
[0003]大豆疫霉根腐病最有效最直接的办法就是抗病品种的应用，因此抗源的筛选就尤为重要。中国是大豆的起源地、野生大豆种质资源十分丰富，对疫霉根腐病的抗源普遍且存在地理差异。分别对东北、黄淮海以及来自于国外的大豆和野生大豆资源进行疫霉根腐病的抗源筛选，结果表明我国不同生态区的大豆品种的抗性多样性丰富，我国具有较多的抗大豆疫霉根腐病的种质。
[0004]目前用于大豆疫霉根腐病抗病性接种鉴定的方法中比较成熟的、通用的是下胚轴伤口菌丝体接种法，菌种选用大豆疫霉菌(phytophthora sojae)，这种接种鉴定方法中对于抗、感材料的评价标准是：加上接菌的时期，接种后发生整株性萎蔫并从接种部位折断、死亡的植株视为感病植株，接种后无变化或接种部位局部褐变，植株继续正常生长的视为抗病植株。野生大豆及其后代的生长特性是其茎秆细弱、蔓生且木质化程度低，在利用下胚轴伤口菌丝体接种法进行鉴定时，由于其茎细弱，在茎上切开伤口时特别容易将茎切断，而且茎的木质化程度非常低，切开伤口完成接菌还未来得及发病时，其茎秆就已经弯曲下垂呈现感病状态，按照该方法的抗感鉴定标准进行评价时无法准确描述试验材料的抗感反应，因此，亟需找寻一种新的方法进行野生大豆及其后代疫霉根腐病抗病性的鉴定，并实现对抗疫霉根腐病新种质野生大豆的创制。

技术实现思路

[0005]本专利技术公开了一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法，克服了由于野生大豆茎细弱、易断，易导致无法准确描述实验材料抗感反应的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008]S1、制备胡萝卜培养基：将新鲜的胡萝卜洗净并切成小块，称取100g，用植物组织搅碎机搅碎，加入适量蒸馏水煮沸30min，用3层纱布过滤，将过滤后的胡萝卜汁定容至500mL，加入10g琼脂，120℃高温高压灭菌20min，灭菌后的培养基倒入事先已灭菌的平皿中，培养基高度为0.5cm；
[0009]S2、供试菌株的培养：菌株为大豆疫霉菌，将大豆疫霉菌10mm
×
10mm的正方形菌块接种于S1所述胡萝卜培养基，于25℃暗培养7d；
[0010]S3、盆栽种植：野生大豆种子破皮处理后，盆栽种植，每盆中分别种植10粒种子，出
苗后每盆中都留有生长一致的幼苗5株，在幼苗第一片三出复叶完全展开后，开始叶片接种鉴定；
[0011]S4、叶片接种鉴定：在S3所述第一片三出复叶完全展开后将其剪下，置于不锈钢托盘内，盘底放无菌纱布并喷施适量蒸馏水保持纱布湿润，用灭菌后的手术刀在叶片上表面中心位置划出划痕伤口，将S2培养好的大豆疫霉菌切取圆形菌块，将所述圆形菌块覆盖于划痕伤口之上，菌丝面向上，同时用接种空白胡萝卜培养基的划痕叶片作为空白对照，用保鲜膜覆盖托盘，托盘置于温度24℃、光照12h/d、相对湿度100％环境下培养；
[0012]S5、野生大豆疫霉根腐病抗性级别的评价：S4处理后的第5天对接种叶片进行病情表型观查，所述病情表型观察的对象为叶片变色程度，并根据所观察到的病情表型计算感病率来确定野生大豆对疫霉根腐病的抗性级别，并对野生大豆的抗性级别进行统计；
[0013]S6、抗性资源的确定：根据S5获得野生大豆的抗性级别数据，将对疫霉根腐病的抗性差异显著的野生大豆资源确定为具有抗性的野生大豆；
[0014]S7、获得种间杂交后代：以农艺性状优良的栽培大豆材料做为母本，以S6中筛选出具有抗性的野生大豆为父本进行杂交，获得F0代杂交粒；次年种植杂交粒F0并收获F1种子，自F2代起，每个生长季节继续种植上一年收获的种子，并以1粒传的方式收获下一代种子直至F5代；
[0015]S8、种间杂交后代疫霉根腐病抗性鉴定：自F2至F5代，每一个世代按S1至S6所述方法进行疫霉根腐病抗性筛选，保留表现为抗疫霉根腐病的植株；
[0016]S9、种间杂交后代表型筛选：F2至F5代，结合S8所述抗疫霉根腐病的植株，进一步考查相关性状筛选出抗疫霉根腐病新种质。
[0017]进一步地，S4所述划痕伤口的长度为叶片长度1/3，所述圆形菌块的直径为叶片长度的1/3。
[0018]进一步地，S5所述感病率计算方法为：感病率＝感病叶片数/接种叶片总数
×
100％，所述感病叶片包括叶片变黄、变褐和失绿。
[0019]进一步地，S5所述抗性级别包括抗病(R)、中间型(I)和感病(S)，所述抗病(R)感病率为0
‑
30.0％，所述中间型(I)感病率为30.1
‑
70.0％，所述感病(S)感病率为70.1
‑
100％。
[0020]进一步地，S7所述野生大豆播种前需进行破皮处理，所述母本晚于父本7
‑
10天播种。
[0021]进一步地，S7所述母本进入盛花期后，选取植株茎上部的发育程度高的花蕾，去除同节位的其它花蕾后用手轻轻捏住花蕾下部，用镊子去掉花蕾的萼片和花冠，然后去掉花药，拴好空白记号牌。
[0022]进一步地，S7所述杂交的授粉方法为：选择当日新开放的花朵，剥开花朵的花瓣，露出花药，将花粉轻轻地涂抹在已去雄的母本花蕾的柱头上，授粉后用新鲜叶片包裹整个去雄花朵，并用牙签固定，在记号牌上做好标注。
[0023]进一步地，S7所述杂交是否成功的检查方法：人工授粉1周后，及时检查杂交是否成功，如杂交成功，则子房已开始膨大，同时检查同节位是否萌发出新的花蕾并及时去除。
[0024]进一步地，S9所述相关性状包括：生育期、倒伏性状、品质性状、产量性状和综合农艺性状。
[0025]本专利技术具有以下有益效果：
[0026]本专利技术利用叶片接种法筛选野生大豆抗源，克服了由于野生大豆茎细弱、易断，易导致无法准确描述实验材料抗感反应的问题，本专利技术通过接种后叶片变黄、变褐或失绿来了解野生大豆资源对疫霉根腐病的抗感反应，通过计算感病率来确定一个准确划分疫霉根腐病抗性级别的评价标准，从而实现准确筛选抗性资源，大大增强了筛选的可靠性。本专利技术确定了野生大豆资源对疫霉根腐病抗性标准评价体系，创建了从野生资源抗性评价筛选到利用筛选的具有抗性的野生大豆进行种间杂交创制抗疫霉根腐病新种质的方法，该方法简单、实用、高效。
附图说明
[0027]图1：一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法流程示意图；
[0028]图2：疫霉根腐病接种叶片示意图；
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1、制备胡萝卜培养基：将新鲜的胡萝卜洗净并切成小块，称取100g，用植物组织搅碎机搅碎，加入适量蒸馏水煮沸30min，用3层纱布过滤，将过滤后的胡萝卜汁定容至500mL，加入10g琼脂，120℃高温高压灭菌 20 min，灭菌后的培养基倒入事先已灭菌的平皿中，培养基高度为0.5cm；S2、供试菌株的培养：菌株为大豆疫霉菌，将大豆疫霉菌取10mm
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10 mm的正方形菌块接种于S1所述胡萝卜培养基，于25℃暗培养7d；S3、盆栽种植：野生大豆种子破皮处理后，盆栽种植，每盆中分别种植10粒种子，出苗后每盆中都留有生长一致的幼苗5株，在幼苗第一片三出复叶完全展开后，开始叶片接种鉴定；S4、叶片接种鉴定：在S3所述第一片三出复叶完全展开后将其剪下，置于不锈钢托盘内，盘底放无菌纱布并喷施适量蒸馏水保持纱布湿润，用灭菌后的手术刀在叶片上表面中心位置划出划痕伤口，将S2培养好的大豆疫霉菌切取圆形菌块，将所述圆形菌块覆盖于划痕伤口之上，菌丝面向上，同时用接种空白胡萝卜培养基的划痕叶片作为空白对照，用保鲜膜覆盖托盘，托盘置于温度24℃、光照12h/d、相对湿度100%环境下培养；S5、野生大豆疫霉根腐病抗性级别的评价：S4处理后的第5天对接种叶片进行病情表型观查，所述病情表型观察的对象为叶片变色程度，并根据所观察到的病情表型计算感病率来确定野生大豆对疫霉根腐病的抗性级别，并对野生大豆的抗性级别进行统计；S6、抗性资源的确定：根据S5获得野生大豆的抗性级别数据，将对疫霉根腐病的抗性差异显著的野生大豆资源确定为具有抗性的野生大豆；S7、获得种间杂交后代：以农艺性状优良的栽培大豆材料做为母本，以S6中筛选出具有抗性的野生大豆为父本进行杂交，获得F0代杂交粒，次年种植杂交粒F0并收获F1种子，自F2代起，每个生长季节继续种植上一年收获的种子，并以1粒传的方式收获下一代种子直至F5代；S8、种间杂交后代疫霉根腐病抗性鉴定：自F2至F5代，每一个世代按S1至S6所述方法进行疫霉根腐病抗性筛选，保留表现为抗疫霉根腐病的植株；S9、种间杂交后代表型筛选：F...

【专利技术属性】
技术研发人员：李炜，刘淼，来永才，毕影东，刘建新，樊超，王玲，杨光，邸树峰，梁文卫，夏天舒，谢婷婷，孙兵，任洋，刘凯，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所，
类型：发明
国别省市：