一种高粱素的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种高粱素的制备方法，特别涉及一种利用基因工程改造的酿酒酵母在制备高粱素中的应用。本发明专利技术提供的一种高粱素的制备方法，通过对酿酒酵母的代谢途径进行改造以提高合成乙酰辅酶A（Acetyl

【技术实现步骤摘要】
一种高粱素的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种高粱素的制备方法，特别涉及一种利用基因工程改造的酿酒酵母在制备高粱素中的应用。
技术背景
[0002]化感作用最开始的定义是指植物通过向环境释放特定的次生物质从而对邻近其它植物生长发育产生的影响。现在，植物化感作用研究事实上已扩展到以植物为中心的一切有机体及环境间通过化学物质为媒介的化学相互作用。1984年Rice在《Allelopathy》第二版中，将化感作用较完整的意义定为：植物或微生物的代谢分泌物对环境中其他植物或微生物有利或不利的作用。这个定义现已被广泛接受。
[0003]《利用化感物质开发除草剂的应用前景》（陈业兵等，山东农业大学学报）指出，从植物中提取有效的化感物质直接应用于生产实际是不太现实的，因为化感物质含量少，提取困难，获得的量也非常少，成本太高。研究植物的化感作用，是在提取、分离和鉴定化感物质的基础上，人工模拟合成化感物质作用较强物质或对一些化感物质进行结构修饰，这将有可能开发出新型除草剂。而在从植物中获得具有开发成除草剂潜力的化感物质，在用于除草剂之前，要解决的问题有：（1）、物质的最低有效浓度；（2）、化感物质的分离和鉴定；（3）、化感物质在土壤中的残留和降解；（4）、化感物质对土壤中微生物生理生化特性的影响；（5）、化感物质的作用方式；（6）、化感物质对作物是否有负面影响；（7）、化感物质对人类健康的影响；（8）、产业化生产化感物质是否是经济合理的。
[0004]对化感物质进行研究，可以选择出新一代农药开发的母体结构。以活性化感物质作为先导化合物可以更快更经济地发现活性更优的类似物。虽然离最终除草剂的问世还需要相当长的时间和较大的经济投入，但是天然除草剂是环保的，在环境问题备受关注的今天，天然除草剂必将具有广阔的前景。
[0005]高粱素（Sorgoleone）是高粱（Sorghum bicolor （L.） Moench）的根中合成并分泌到土壤中的苯醌类化感物质（Allelochemicals），它能通过竞争光合系统II中质体醌的结合位点，从而抑制其它植物的光合作用；同时能阻碍线粒体中的电子转移反应，从而对其它植物产生直接的或间接的有害作用。有研究报道高粱素对包括阔叶、单子叶和双子叶等多种杂草的生长表现出显著的抑制作用。由于高粱素对人和动物安全，且具有除草高效及无环境污染等特点，使其在新型除草剂开发方面具有广阔的前景。
h；然后用无菌离心管在（2000~4000）g离心2~10 min收集菌体，并转移至YPG培养基中，在28~32℃，180 ~220 rpm摇床中培养40~55h；外加脂肪酸培养时，以0.05~0.2%（v/v）的终浓度加入；f、收集发酵后的菌体，使用液氮研磨法将菌体粉化；进行产物的提取和检测。
[0011]或者，一种高粱素的制备方法，包括以下步骤：a、获得改进的高粱素合成基因， DES2、DES3、ARS1、ARS2、OMT3、P450、ATR1；b、将DES2和DES3、A1O（指ARS1或ARS2）和OMT3、P450和ATR1两两分组分别构建到pESC系列载体的多克隆位点1和多克隆位点2处，使用引物T
ADH1
和T
CYC1
，将包含两端终止子序列的表达盒片段进行扩增、纯化，获得片段1、2、3；从pESC
‑
URA 载体上用引物URA
‑
F和URA
‑
R扩增获得尿嘧啶URA3编码序列的表达盒片段4；合成酿酒酵母基因组的非同源连接片段L1
‑
L4，通过同源重组的方式将连接片段与上述表达盒1、2、3、4进行拼接，获得URA
‑
L1、L1
‑ꢀ
DES2
‑ꢀ
DES3
‑
L2、L2
‑ꢀ
A1O
‑
OMT3
‑
L3、L3
‑ꢀ
P450
‑
ATR1
‑
L4基因片段；提取酿酒酵母基因组，扩增整合位点YPRC
∆
15两端同源臂site1和site2，并且通过同源重组方式，拼接获得片段site1
‑
URA
‑
L1和L4
‑ꢀ
site2；将site1
‑
URA
‑
L1、L1
‑ꢀ
DES2
‑ꢀ
DES3
‑
L2、L2
‑ꢀ
A1O
‑
OMT3
‑
L3、L3
‑ꢀ
P450
‑
ATR1
‑
L4和L4
‑ꢀ
site2五个片段分别扩增、纯化，通过电击转化法转化到酿酒酵母CEN.PK2
‑
1C中，使用SD
‑
URA固体缺陷培养基培养2~3天，挑选单克隆，进行基因型验证，将阳性菌株进行保菌，得到BY
‑
ZJUT
‑
ZH2菌株；c、将保存的甘油菌BY
‑
ZJUT
‑
ZH2菌株在平板上划线，28~32℃培养2~4 d；长出单菌落后，挑取单菌落于液体培养基中，在摇床中，28~32℃，200~250 rpm培养8~15 h；培养好的种子液继续扩大培养至200 mL，接种初始OD
600
为0.03~0.06，在摇床中，28~32 ℃，200~250 rpm培养8~16h；d、将培养好的二级种子液接种至发酵罐进行发酵，培养温度为28~32 ℃，初始搅拌转速为600~1000 rpm，根据发酵过程中溶氧水平搅拌转速最高可调整至1200 rpm，pH通过补加氨水控制在5.6左右；本步骤培养基组成为：4~6 g/L （NH4） 2
SO4，2~4g/L KH2PO4，0.03~0.07 g/L MgSO4，50~70 mg/L尿嘧啶，50~70mg/L色氨酸，10~30 g/L葡萄糖以及本领域常规使用量的金属元素和维生素溶液；e、培养4~6 h后，补加培养基13~16 g/L （NH4） 2
SO4，8~10 g/L KH2PO4，1.2~1.8 g/L MgSO4，160~200 mg/L尿嘧啶，160~200 mg/L色氨酸，50~70g/L葡萄糖，以及步骤C中三倍使用量的金属元素和维生素溶液，继续培养；f、继续培养4~6 h后，补加培养基23~28 g/L （NH4） 2
SO4，12~18 g/L KH2PO4，2.~3 g/L MgSO4·
7H2O，250 ~350mg/L尿嘧啶，250 ~350 mg/L色氨酸，80~120 g/L半乳糖以及步骤C中五倍使用量的金属元素和维生素溶液，继续培养18~30 h；g、培养结束后，通过离心收集菌体，进行产物的提取和检测。
[0012]本专利技术上述技术方案中，DES2的序列，为序列表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高粱素的制备方法，包括以下步骤：a、获得改进的高粱素合成基因， DES2、DES3、ARS1、ARS2、OMT3及CYP71AM1；b、通过同源重组的方式将DES2基因和DES3基因分别构建至真核表达载体pESC
‑
His的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1，将ARS1基因和OMT3基因分别构建至真核表达载体pESC
‑
Ura的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1，将ARS2基因和OMT3基因分别构建至真核表达载体pESC
‑
Ura的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1，将CYP71AM1基因和来源于拟南芥的ATR1基因分别构建至真核表达载体pESC
‑
Leu的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1；c、将pESC
‑
His
‑
DES2
‑
DES3质粒、pESC
‑
Ura
‑
ARS1
‑
OMT3或pESC
‑
Ura
‑
ARS2
‑
OMT3、和pESC
‑
Leu
‑
CYP71AM1
‑
CPR利用酵母转化试剂盒转化入酿酒酵母BY4741，涂布于Sc
‑
His
‑
Leu
‑
Ura筛选平板，28~32℃下培养2~4 d；长出单菌落后，在超净工作台中挑取单菌落于Sc
‑
His
‑
Leu
‑
Ura液体筛选培养基，在摇床中，28~32 ℃，200~250 rpm培养；取培养好的菌液，用引物Gal1
‑
F/R和Gal10
‑
F/R进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物中是否包含所有目的条带；将包含所有目的条带的菌株命名为BY
‑
ZJUT
‑
ZH1，加入甘油，冻存；d、将菌BY
‑
ZJUT
‑
ZH1在Sc
‑
His
‑
Leu
‑
Ura筛选平板上划线，28~32℃培养2~4 d，挑取平板上的重组酿酒酵母单菌落到培养基中，在摇床中28~32 ℃，180 ~220rpm过夜；将菌体转移到新的培养基中，使其初始OD
600
=0.5，继续在28~32 ℃，180 ~220rpm摇床中培养18~26 h；然后用无菌离心管在（2000~4000）g离心2~10 min收集菌体，并转移至YPG培养基中，在28~32℃，180 ~220 rpm摇床中培养40~55h；外加脂肪酸培养时，以0.05~0.2%（v/v）的终浓度加入；f、收集发酵后的菌体，使用液氮研磨法将菌体粉化；进行产物的提取和检测。2.一种高粱素的制备方法，包括以下步骤：a、获得改进的高粱素合成基因， DES2、DES3、ARS1、ARS2、OMT3、P450、ATR1；b、将DES2和DES3、A1O和OMT3、P450和ATR1两两分组分别构建到pESC系列载体的多克隆位点1和多克隆位点2处，使用引物T
ADH1
和T
CYC1
，将包含两端终止子序列的表达盒片段进行扩增、纯化，获得片段1、2、3；从pESC
‑
URA 载体上用引物URA

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小龙，周家伟，陆跃乐，朱林江，吕旭浩，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：