【技术实现步骤摘要】
一种ALB融合蛋白的表达方法及其应用
[0001]本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种ALB融合蛋白的表达方法及其应用。
技术介绍
[0002]人诱导多能干细胞（iPSC）可以被分化为各种类型的细胞，包括肝样细胞（iHeps）。由于人iPSC可以无限扩增的特性，为药物筛选，肝脏毒性测试，以及用于细胞替代疗法的再生医学提供数量无限的肝脏细胞。不过，现有分化方案获得的iHeps与成人肝细胞在成熟度方面仍有些差距，并且分化而来的iHeps群体中细胞不均一，含有不同分化阶段的iHeps以及其他的细胞类型，因此，建立携带肝细胞谱系特异的荧光蛋白或其他报告基因的iPSC尤为重要。ALB为编码人血白蛋白的基因，是肝脏细胞特异性表达的基因，且表达量非常高。因此，通过给ALB添加融合蛋白，包括各类报告基因，可以标记iPSC分化而来的iHeps。但是采用何种ALB融合蛋白的表达方法，可以具有更好的效果，分选获得纯度较高的肝细胞，且对肝细胞代谢不造成干扰，目前还未见有相关文献报道。
技术实现思路
[0003]针对以上技术...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种ALB融合蛋白的表达方法，其特征在于：其包括：利用核酸酶切割基因组，在人多能干细胞或肝脏细胞ALB基因终止密码子前通过基因共表达连接元件给ALB基因同时添加2个融合蛋白基因；所述融合蛋白基因为报告基因、功能基因、基因片段、细胞表面蛋白、或报告基因、功能基因、基因片段、细胞表面蛋白中两种或以上的组合；所述报告基因为荧光蛋白基因、细胞表面抗原、荧光素酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β
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半乳糖苷酶基因、分泌性人胎盘碱性磷酸酶基因或PET报告基因；使用人多能干细胞，通过定向分化技术分化为肝脏细胞。2.根据权利要求1所述的ALB融合蛋白的表达方法，其特征在于：所述核酸酶为锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或规律间隔成簇短回文重复序列Cas系统。3.根据权利要求1所述的ALB融合蛋白的表达方法，其特征在于：其包括如下步骤：步骤S1，设计CRISPR/Cas9 sgRNA序列，使切割位点位于ALB终止密码子附近； CRISPR识别位点的序列如SEQ ID NO.1；步骤S2，按左同源臂LHA
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基因共表达连接元件
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感兴趣的基因或DNA片段
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右同源臂RHA的结构构建供体质粒；步骤S3，构建ALB
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感兴趣的基因或DNA片段细胞株：将步骤S2得到的供体质粒载体与靶向ALB的CRISPR
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Cas9载体一起转染至目的细胞，转染后24
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48小时后加入嘌呤霉素处理；24小时后撤掉嘌呤霉素换新鲜培养基，待细胞长到30
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60%汇合率时进行单细胞克隆；通过有限稀释法获得单个细胞来源的克隆后，进行挑取，利用Junction PCR鉴定克隆；步骤S4，iPSC定向分化为iHeps：通过三个阶段定向分化将人iPSCs分化成iHeps，第一阶段利用培养基S1处理24小时，之后2天使用培养基S1培养，获得DE细胞；第二阶段是将DE细胞诱导为肝母细胞，这一阶段使用培养基S2培养7天；第三阶段采用培养基S3培养7天或以上。4.根据权利要求1所述的ALB融合蛋白的表达方法，其特征在于：所述功能基因为PD
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L1基因。5. 根据权利要求1所述的ALB融合蛋白的表达方法，其特征在于：所述基因连接元件为2A肽或IRES序列；所述感兴趣的基因或DNA片段为mCherry和/或CD8；所述P2A的序列如SEQ ID NO.8，mCherry的序列如SEQ ID NO.9，CD8的序列如SEQ ID NO.10；左同源臂ALB
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LHA的序列如SEQ ID NO.11，右同源臂ALB
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RHA的序列如SEQ ID NO.12。6.根据权利要求5所述的ALB融合蛋白的表达方法，其特征在于：步骤S2采用如下步骤构建供体质粒：步骤S201，使用LHA
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PF引物和LHA
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PR引物扩增出LHA
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SalI，使用RHA
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PF引物和RHA
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PR引物扩增出SphI
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RHA
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HindIII；其中LHA
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PF引物的序列如SEQ ID NO.4，LHA
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PR引物的序列如SEQ ID NO.5，RHA
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PF引物的序列如SEQ ID NO.6，RHA
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PR引物的序列如SEQ ID NO.7，步骤S2...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨佳银，付建，江利香，杨波，
申请(专利权)人：深圳市三启生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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