一种通用型分离细菌的磁性纳米材料制备方法技术

本发明专利技术公开了一种通用型分离细菌的磁性纳米材料制备方法，以期为后续更好地进行目的菌的高灵敏检测提供基础，涉及材料化学领域和生物技术领域。该方法包括磁性纳米粒子与聚乙二醇的偶联、氨苄青霉素偶联聚乙二醇偶连的磁性纳米粒子、氨苄青霉素

【技术实现步骤摘要】
一种通用型分离细菌的磁性纳米材料制备方法


[0001]本专利技术涉及材料化学领域和生物
，具体涉及基于磁性纳米材料的合成及细菌分离方法。

技术介绍

[0002]食源性致病菌是可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌，是导致食品安全问题的重要因素。人经口感染可导致肠道传染病的发生、食物中毒以及畜禽传染病的爆发。1980
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2014年，美国有超过四百万人死于由病原微生物引起的各种传染病。因此，开发一种检测食品中致病菌的快速筛查方法是必要的。鉴于需要建立一种高效、快速、抗基质干扰能力强的检测方法，基于功能化的磁性纳米粒子的分离技术在致病菌监测中得到了迅速发展。

技术实现思路

[0003]针对现有技术需复杂的前处理步骤，费时费力等缺陷，本专利技术旨提供一种捕获效率高、分离时间短、操作简便，低梯度磁场下从复杂基质中广谱性分离目的细菌的方法。
[0004]本专利技术具体是通过如下技术方案实现的：
[0005]细菌的快速分离方法包括以下步骤：
[0006]1)将磁性纳米粒子用无菌PBS洗涤后重悬于无菌MES溶液中，得到磁性纳米粒子溶液；
[0007]2)分别将EDC和NHSS溶解于无菌MES溶液，得到EDC溶液及NHSS溶液，然后加入至步骤1)得到的磁性纳米粒子溶液，室温条件下活化0.5～2h，将活化后的磁性纳米粒子再次洗涤重悬，得到活化后的磁性纳米粒子溶液；
[0008]3)将聚乙二醇溶于无菌MES溶液，得到聚乙二醇溶液，然后加入至步骤2)得到的活化后的磁性纳米粒子溶液，室温反应2～5h后，将反应产物洗涤重悬，得到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子复合物；
[0009]4)将EDC溶液及NHSS溶液加入至步骤3)所得溶液，室温条件下活化0.5～2h，将活化后的聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子复合物再次洗涤重悬，得到活化后的聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子复合物溶液；
[0010]5)将氨苄青霉素溶解于无菌MES溶液，得到氨苄青霉素溶液，氨苄青霉素溶液加入至步骤4)得到的活化后的聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子复合物溶液，室温反应3～7h，将反应产物洗涤重悬，得到氨苄青霉素
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聚乙二醇
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磁性纳米粒子复合物；
[0011]6)将步骤5)制备得到的氨苄青霉素
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聚乙二醇
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磁性纳米粒子复合物加入至含细菌的溶液中，置于混匀仪上，以15rpm的转速在室温下孵育10～40min，插入磁力架分离4～7min，分离产物洗涤后重悬即得细菌
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氨苄青霉素
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聚乙二醇
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磁性纳米粒子复合物。
[0012]进一步地，步骤1)所述磁性纳米粒子粒径为180nm，表面为羧基。
[0013]进一步地，步骤3)所述聚乙二醇分子为一端氨基一端羧基的分子，其分子量为
2000。
[0014]进一步地，步骤5)所述氨苄青霉素分子，其分子量为371.39。
[0015]磁珠表面的羧基与聚乙二醇的氨基端相连，氨苄青霉素表面氨基与聚乙二醇的羧基端相连，然后氨苄青霉素的β
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内酰胺键与细菌细胞膜表面的青霉素结合蛋白结合。
[0016]本方法适用于从复杂样品基质中富集分离细菌，如食品、脑脊液、血液、腹水等样本。样本处理按照常规处理方法即可，如将固体样本粉碎后制成待测溶液。
[0017]采用本专利技术技术方案具有如下有益效果：
[0018]1、本专利技术采用的是的180nm的磁性纳米粒子，主要用于基质中目的菌的快速富集，而现有技术采用30nm或者50nm磁珠结合树状分子的富集方法是用于磁信号的放大。
[0019]2、本专利技术采用的氨苄青霉素是β
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内酰胺类抗生素，相比于抗体，具有稳定性好，成本低，质量可控等优点。基于上述优点，在单次分离过程中，本专利技术构建的氨苄青霉素
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聚乙二醇
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磁性纳米粒子复合物在成本上比免疫磁分离成本大大降低，在材料稳定性以及保质期方面比免疫磁珠更好。
[0020]3、食品基质与医院样本是多种细菌共存的环境。本专利技术采用的氨苄青霉素是识别细菌的广谱性分子识别剂，可以将基质中的大多数细菌都分离出来。相比之下，抗体因其具有较强的特异性，从而仅能分离出对应的目的菌，其他存在于基质中的细菌无法鉴别，不适用于快速筛查多种未知目的菌的样本。
[0021]4、本专利技术合成的氨苄青霉素
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聚乙二醇
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磁性纳米粒子复合物是先通过EDC/NHSS法将磁珠表面的羧基活化，再利用活化后的羧基与聚乙二醇的氨基端进行共价结合，然后通过EDC/NHSS法将聚乙二醇的羧基活化，最后将氨苄青霉素的氨基与聚乙二醇的羧基进行共价结合，避免了常规方法中直接将氨苄青霉素分子直接偶联在磁性纳米粒子表面而产生的氨苄青霉素分子活性降低和空间位阻大的缺点。同时聚乙二醇作为分子臂具有很好的灵活性，有利于氨苄青霉素分子与细菌表面的青霉素结合蛋白分子相连，从而提高了捕获效率。
[0022]5、本专利技术将氨苄青霉素修饰于磁性纳米粒子表面，相比于替考拉宁修饰磁性纳米粒子的方法，本专利技术中使用的氨苄青霉素分子针对细菌具有广谱性，氨苄青霉素
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聚乙二醇
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磁性纳米粒子复合物可以分离到基质中存在的大多数细菌，且孵育时间更短，分离效率更高。
[0023]6、本专利技术合成的氨苄青霉素
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聚乙二醇
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磁性纳米粒子复合物是通过氨苄青霉素的β
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内酰胺结构与细菌细胞膜表面的青霉素结合蛋白进行结合，相比于抗体、替考拉宁等识别分子基于特定生物标志物受体的相互作用方法，本专利技术的氨苄青霉素
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聚乙二醇
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磁性纳米粒子复合物与细菌相互作用力更强，分离细菌的能力更强，特别适用于复杂样品中细菌的富集分离。
附图说明
[0024]图1本专利技术具体实施方式中磁性纳米材料制备原理示意图。
具体实施方式
[0025]为了使本专利技术更加清楚明白，以下结合实施例及附图，对本专利技术进行进一步详细
说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0026]由图1可见，先通过EDC/NHSS法将磁珠表面的羧基与聚乙二醇的氨基端相连，然后再将氨苄青霉素表面氨基与聚乙二醇的羧基端相连，最后氨苄青霉素的β
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内酰胺键与细菌细胞膜表面的青霉素结合蛋白结合，继而得到细菌
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氨苄青霉素
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聚乙二醇
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磁性纳米粒子复合物。
[0027]下列实施例中：磁性纳米粒子(180nm)购买于上海奥润有限公司。
[0028]氨苄青霉素(分子量371.39)，购自大连美伦生物科技有限公司。
[0029]聚乙二醇(分子量2000)，购自上海阿拉丁生化科技股份有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.通用型分离细菌的磁性纳米材料制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)将磁性纳米粒子用无菌PBS洗涤后重悬于无菌MES溶液中，得到磁性纳米粒子溶液；2)分别将EDC和NHSS溶解于无菌MES溶液，得到EDC溶液及NHSS溶液，然后加入至步骤1)得到的磁性纳米粒子溶液，室温条件下活化0.5～2h，将活化后的磁性纳米粒子再次洗涤重悬，得到活化后的磁性纳米粒子溶液；3)将聚乙二醇溶于无菌MES溶液，得到聚乙二醇溶液，然后加入至步骤2)得到的活化后的磁性纳米粒子溶液，室温反应2～5h后，将反应产物洗涤重悬，得到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子复合物；4)将EDC溶液及NHSS溶液加入至步骤3)所得溶液，室温条件下活化0.5～2h，将活化后的聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子复合物再次洗涤重悬，得到活化后的聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子复合物溶液；5)将氨苄青霉素溶解于无菌MES溶液，得到氨苄青霉素溶液，氨苄青霉素溶液加入至步骤4)得到的活化后的聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子复...

【专利技术属性】
技术研发人员：许恒毅，白雪锟，王铮铮，李伟强，谢飞，肖芳斌，黄瑾，徐倩，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：