一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，公开了一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法：分离患者外周血中的免疫细胞，制成单细胞悬液，进行单细胞转录组测序，最后用CellChat软件分析细胞间的通讯方式。本发明专利技术提供的分析方法充分考虑了配体

【技术实现步骤摘要】
一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法。

技术介绍

[0002]原发性干燥综合征(primary Sjogren
’
s syndrome，pSS)是一种以淋巴细胞增殖及进行性外分泌腺体损伤为特征的慢性炎症性自身免疫病，患者血清中存在多种自身抗体，发病率为0.5％～1.0％，其中90％以上为女性。临床表现为口干、眼干、关节疼痛、疲乏等不适症状，约有1/3的患者存在肺、肾、神经系统、血管或淋巴系统等多系统的损害，其确切的病因及发病机制仍不十分清楚，属于难治性疾病。
[0003]细胞通讯是指由一个细胞发出的信号通过介质传递到另一个细胞并产生相应反应的过程，是多细胞生物分化、发育和器官形成等生理活动的重要功能基础，同时也在各类疾病的发生发展中扮演重要角色。细胞微环境是由相邻的细胞和非细胞成分共同构成的局部生态系统。正常组织的细胞微环境处于平衡状态，而出现感染等异常状况时进入前炎症状态，随后可发展为炎症状态，严重时可发展成急性炎症状态。在组织局部炎症的发展过程中，免疫系统介导的细胞通讯网络可产生状态转换，通过细胞间的信号传递激活或抑制相应的细胞功能，从而影响炎症的发展。迄今为止，尚不清楚原发性干燥综合征患者外周血免疫细胞之间如何相互作用以及细胞通讯参与的病理过程。
[0004]近年来，随着单细胞测序技术的不断发展，使得人们可获得单细胞水平的基因表达信息，其中包含大量介导细胞间通讯的配体和受体的表达信息。因此如何从单细胞测序数据中准确提取出细胞间的通讯信息成为当前生物信息学领域的研究热点，当前已经开发了几种方法用于在单细胞转录组测序(scRNA
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seq)数据中推断细胞间的通讯关系，例如SingleCellSingalR，iTALK和NicheNet，但这些方法只使用一个配体/受体基因对，常常忽略了许多受体中的多亚基复合物的作用，例如，来自TGF
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β途径的可溶性配体通过Ⅰ型和Ⅱ型受体的异聚复合物发出的信号。基于以上问题，开发的CellPhoneDB v2.0可以预测两个细胞群之间的信号相互作用，但是，并未考虑其他重要的信号辅助因子，包括可溶性激动剂、拮抗剂以及刺激性和抑制性的膜结合型共受体。
[0005]因此有必要提供一种将细胞通讯和信号功能通路相结合的分析方法，以研究原发性干燥综合征患者外周血中免疫细胞的细胞通讯变化对该疾病发展带来的影响。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法，能够将细胞通讯和细胞功能通路的分析相结合，对单细胞转录组测序数据进行分析，进而研究原发性干燥综合征患者外周血中免疫细胞的细胞通讯变化。
[0007]根据本专利技术的一个方面，提出了一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法，包括以下步骤：
[0008]S1：分离原发性干燥综合征患者外周血中的免疫细胞，制成单细胞悬液；
[0009]S2：对步骤S1所述的单细胞悬液进行单细胞转录组测序；
[0010]S3：加载经步骤S2所述单细胞转录组测序得到的表达数据，利用分析软件导入综合性配体受体数据库，对所述表达数据进行预处理，以识别所述细胞中过表达的配体和受体之间的相互作用；推断所述表达数据中细胞状态特定的信号通讯；通过可视化输出、社交网络分析工具、模式识别方法和学习方法中的至少一种对细胞通讯进行定量表征和比较。
[0011]根据本专利技术的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
[0012]本专利技术进行细胞通讯分析时使用的分析软件为CellChat，这一分析软件充分考虑了配体
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受体相互作用的已知结构组成，例如多聚体配体
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受体复合物、可溶性激动剂和拮抗剂、刺激性和抑制性膜结合型共受体，解决了相关技术中没有考虑配体和受体以外的其他重要信号辅因子的问题；另外，利用以上分析软件进行分析，操作简单，将细胞通讯与细胞功能通路的研究相结合，再结合单细胞转录组测序可对原发性干燥综合征患者外周血中的免疫细胞之间的通讯方式进行全面分析，以明确细胞通讯变化对疾病发展带来的影响，为寻找原发性干燥综合征相关疾病的治疗靶点以及探究细胞通讯与细胞生物学功能之间的调控机制提供了全新的思路。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S1采用离心法制备所述单细胞悬液，具体方法包括：将收集的抗凝外周血样本置于离心机中，3000～3500rpm，离心5～8min，移去上层血浆，保留血细胞；在离心管中加入磷酸盐缓冲液(PBS)，再加入与所述PBS等体积的血细胞，混匀制成混合液；在另一个离心管中加入人淋巴细胞分离液，吸取所述混合液缓慢加入所述人淋巴细胞分离液的上方，保持液面分界清晰，置于离心机中，2000～2500rpm，离心20～25min，吸取中间白膜层置于装有所述PBS的离心管中，混匀，于4～6℃条件下，1300～1500rpm离心5～8min，弃去上清，收集底层细胞，用所述PBS清洗，得所述单细胞悬液。
[0014]在本专利技术的一些优选的实施方式中，将收集的抗凝外周血样本置于离心机中，3000rpm，离心5min。
[0015]在本专利技术的一些优选的实施方式中，将所述混合液加入所述人淋巴细胞分离液中，置于离心机中，2000rpm离心20min，吸取中间白膜层置于装有所述PBS的离心管中，混匀，于4℃条件下，1300rpm离心5min。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S2中首先将所述单细胞悬液、凝胶微珠和油分别加入芯片的不同小室中。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述凝胶微珠上依次连接有测序引物、barcode序列、UMI序列和多聚T序列。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述测序引物用于上机测序。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述barcode序列用于区分所述凝胶微珠。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述UMI序列为包含随机碱基的序列，用于区分DNA样本。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述多聚T序列与mRNA的多聚A尾巴结合，作为逆转录引物。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，在加入所述单细胞悬液、所述凝胶微珠和所述油后，运行仪器，经由微流体双十字交叉系统形成油滴包裹的凝胶珠。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，收集所述油滴包裹的凝胶珠并混合，所述凝胶微珠在每个油滴内自动溶解释放大量的所述barcode序列，细胞释放所述mRNA，所述mRNA与逆转录酶、所述凝胶微珠上的多聚T序列及dNTP接触，发生逆转录反应，产生用于测序的带有所述barcode序列和所述UMI序列的cDNA一链，再以SMART扩增方式形成所述cDNA的二链。
[0024]在本专利技术的一些实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：分离原发性干燥综合征患者外周血中的免疫细胞，制成单细胞悬液；S2：对步骤S1所述的单细胞悬液进行单细胞转录组测序；S3：加载经步骤S2所述单细胞转录组测序得到的表达数据，利用分析软件导入综合性配体受体数据库，对所述表达数据进行预处理，以识别所述细胞中过表达的配体和受体之间的相互作用；推断所述表达数据中细胞状态特定的信号通讯；通过可视化输出、社交网络分析工具、模式识别方法或学习方法中的至少一种对细胞通讯进行定量表征和比较。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤S3中对所述表达数据进行预处理的方法为：先在一个细胞组中识别过表达的配体或受体，然后将所述表达数据投射到蛋白
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蛋白相互作用网络上，如果所述配体或所述受体过表达，则识别过表达的所述配体和所述受体之间的相互作用。3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述一个细胞组包括一个表达所述配体的细胞和一个表达所述受体的细胞。4.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，步骤S3中，推断所述表达数据中细胞状态特定的信号通讯的具体方法为：为每个所述相互作用中的配体
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受体对从所述细胞组中的一个细胞到另一个细胞的通信分配一个概率值，对通信概率建立质量互作模型，通过计算与每个信号通路相关的所有配体
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受体相互作用的通信概率，来推断所述每个信号通路水平上的通信概率，进而推断所述信号...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴勇，侯显良，汤冬娥，洪小平，刘冬舟，蔡晚霞，
申请(专利权)人：深圳市人民医院，
类型：发明
国别省市：