一种促进心肌再生的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种促进心肌再生的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶及其制备方法与应用，属于生物医学技术领域。重组人CHK1蛋白激酶包括CHK1蛋白激酶序列和穿膜肽序列，注射给药后可通过激活心肌再生的关键通路来影响心肌细胞DNA合成、细胞周期、有丝分裂等进程，促进急性心肌梗死后的心肌再生修复，减少心肌梗死面积和纤维化，改善心功能的恢复。同时小分子水凝胶液态凝固形成的三维网状结构可为心室提供机械支撑力，延缓心室重构；小分子水凝胶的多孔隙结构，便于再生心肌细胞的生长从而促进心肌修复。肌修复。肌修复。

【技术实现步骤摘要】
一种促进心肌再生的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种以水凝胶为载体的重组人CHK1蛋白激酶产品及其应用。

技术介绍

[0002]随着临床医疗技术的不断发展，急性心肌梗死患者的死亡率虽然有所降低，但其仍然是威胁人类生命的严重疾病。急性心梗发生后，尽早、充分、持续开通梗死相关冠状动脉，挽救缺血濒死心肌、保护心功能是目前治疗急性心肌梗死的主要策略。然而，目前无论药物溶栓、经皮冠状动脉介入治疗或冠状动脉旁路移植等心梗后再灌注手段，都只能改善心肌的血液供应，而并不能增加心肌细胞的数量或使已坏死的心肌再生，心梗发生后损伤区域仍由纤维瘢痕修复，将不可避免地降低心肌收缩力，从而在疾病远期预后中导致心脏重构、心功能障碍甚至心力衰竭终末事件的发生。实现心肌细胞的有效再生，减少瘢痕形成对逆转或延缓心肌梗死后疾病的进展具有重要意义，这也是目前心血管领域的重大难题之一。
[0003]长期以来研究者们一直认为，由于心肌细胞在出生后即进入终末分化而退出细胞周期，心肌损伤导致的心肌细胞减少是不可逆的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含有CHK1蛋白激酶
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穿膜肽融合蛋白的可注射水凝胶，其特征在于，由所述融合蛋白与成胶前体分子在水相中混匀而成，所述融合蛋白包括CHK1蛋白激酶序列和TAT穿膜肽序列，所述CHK1蛋白激酶序列和所述TAT穿膜肽序列通过连接肽连接，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述成胶前体分子为dFEFKdFEFKYRGD。2.根据权利要求1所述含有CHK1蛋白激酶
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穿膜肽融合蛋白的可注射水凝胶，其特征在于，所述融合蛋白与成胶前体分子的质量比为1：(1.9～2.1)。3.一种根据权利要求1所述可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)称取所述成胶前体分子粉末，室温下用双蒸水充分溶解，过滤灭菌，用无菌碳酸氢钠调pH至7.3
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7.5，按照成胶前体分子浓度为18
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22mg/mL浓度的定容，得到A液，备用；(2)取含有所述融合蛋白的溶液，加无菌PBS使蛋白溶液的浓度为9
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11mg/mL，得到B液，备用；(3)室温下将步骤(1)得到的A液和步骤(2)得到的B液混合，缓慢吹打混匀，得到可注射水凝胶。4.一种CHK1蛋白激酶
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穿膜肽融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：第一步：合成CHK1蛋白激酶
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穿膜肽融合蛋白TAT
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CHEK1的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ NO.3所示；第二步：构建pFastBacHTA
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CHEK1昆虫细胞载体(1)质粒设计：pUCori，F1ori终止子:SV40poly(A)signal；酶切位点5
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BamHI，3
’
HindIII；TAT
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CHEK1引物序列：F：CTGTATTTTCAGGGCGCCATGGATCCCATGGACTACAAGGACGACGR：CCTCTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCC(2)PCR扩增TAT
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CHEK1片段，并进行鉴定纯化使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase试剂盒，体系条件如下：引物各稀释到10nmol/ul浓度加入到反应体系中；PCR 50ul反应体系：PCR反应条件：
PCR出来的产物进行纯化，纯化步骤：binding buffer，12000rpm离心1分钟；Washing buffer12000rpm，1min清洗两次；再用20
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50ul的水洗脱下来；(3)连接载体与TAT
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CHKE1进行重组MultiS One Step Cloning Kit试剂盒进行重组：每个片段最适使用量＝[0.02
×
片段碱基对数]ng例如，将长度分别为0.5kb、1kb、2kb的插入片段克隆至长度为5kb的克隆载体时，载体与各片段最适使用量为：线性化克隆载体最适使用量：0.02
×
5000＝100ng；0.5kb插入片段最适使用量：0.02
×
500＝10ng；1kb插入片段最适使用量：0.02
×
1000＝20ng；2kb插入片段最适使用量：0.02
×
2000＝40ng；A.线性化克隆载体的使用量应在50ng
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200ng之间；当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可；B.各插入片段的使用量应大于10ng；当使用上述公式计算最适使用量低于这个值时，直接使用10ng即可；C.线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4μl；重组反应：于冰上配置以下反应体系：为了确保加样的准确性，在配置重组反应体系前可将线性化载体与插入片段进行适当稀释，个组分加样量不能低于1ul；(4)重组产物鉴定PCR鉴定或测序鉴定；第三步：DH10Bac感受态细胞转化(1)取感受态细胞置...

【专利技术属性】
技术研发人员：王连生，范燚，王昊，郭雪江，陈秉瑞，韦天文，李亚飞，王子牧，程毅伟，沙家豪，
申请(专利权)人：王连生，
类型：发明
国别省市：