用于检测肿瘤细胞内microRNA-203的双光子荧光纳米探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于检测肿瘤细胞内microRNA

【技术实现步骤摘要】
用于检测肿瘤细胞内microRNA
‑
203的双光子荧光纳米探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及纳米材料与生物传感器
，尤其涉及一种用于检测肿瘤细胞内microRNA
‑
203的双光子荧光纳米探针及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]MicroRNA作为一种短链、非编码、内源性RNA，不仅广泛的参与早期发育、细胞增殖、分化、凋亡等多种生物过程的调控，同时其表达水平与各种疾病密切相关，因此microRNA可以做研究许多疾病的重要标志物。特别的是，microRNA的异常表达(上调或下调)与癌症的发生发展密切相关，被认为是不同癌症预后、诊断和治疗过程中有前景的生物标志物。由于细胞内microRNA的含量普遍较低，因此人们致力于发展能够特异性、高灵敏的检测microRNA的方法。现有技术中，反转录
‑
聚合酶链反应(RT
‑
PCR)是一种传统的检测低浓度RNA信号放大策略，但是其只能够在缓冲液中操作，无法反映在细胞中表达的差异；基于等温酶信号放大的原位杂交(FISH)策略，由于酶向内运输需要细胞的固定，只能够实现对单细胞的microRNA成像，不适宜用于活细胞成像。最近几年，基于无酶信号放大目标物，实现对活细胞中低浓度microRNA的检测与成像成为人们关注的重点。催化发夹组装(CHA)是一种能够很好实现原位痕量目标物的信号放大策略，其有望实现对细胞中原位microRNA的荧光成像。
[0003]荧光成像作为一种目前常用的可视化、动态监测活细胞变化的技术，已经被广泛的应用在生物医学研究和分子诊断。传统的荧光成像手段容易受到生物背景自身荧光的干扰，以及外部环境的干扰，而荧光共振能量转移(FRET)作为一种比率性荧光成像的手段能够很好消除背景信号的干扰，且不受外界因素的干扰，实现对细胞内物质的精准定量。同时传统的荧光成像手段组织成像穿透深度低，无法实现较大组织穿透深度的成像，而具有更深组织穿透深度、更低荧光背景、高时空分辨的双光子成像能够很好地避免上述问题。将FRET和双光子成像结合不仅能够减少生物自发荧光背景干扰，同时能够获得较大组织穿透深度的信息，实现对生物样品的无损、高灵敏精准定量。
[0004]基于上述的研究背景，如能构建了一种基于触发性CHA信号放大和FRET策略的核酸功能化双光子硅纳米复合探针，就有望用于监测活细胞内源性microRNAs的表达，对于组织成像和活体成像技术的发展具有重要意义。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术的目的是构建一种能够精准定量不同肿瘤细胞中痕量microRNA
‑
203的荧光探针，联合催化发夹自组装(CHA)信号放大策略和荧光共振能量转移(FRET)的方法实现对细胞中microRNA
‑
203的成像和检测。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供一种用于检测肿瘤细胞内microRNA
‑
203的双光子荧光纳米探针，包括双光子硅纳米颗粒、羧基荧光素和发夹结构DNA，所述双光
子硅纳米颗粒上修饰了发夹DNA1，发夹DNA2上修饰了所述羧基荧光素，所述双光子硅纳米颗粒作为能量供体，所述羧基荧光素作为荧光受体。
[0007]进一步地，所述发夹DNA1的序列为：5'
‑
TTT AGG ACC ACT AGG GTG TGT GTG GGC TAG TGG TCC TAAACATTTCAC
‑
NH2‑
3'，所述发夹DNA2的序列为：5'
‑
GGT GTG TGT GGG(T
‑
FAM)TTA GGACCACTAGCC CAC ACA CAC CCT AGT GGT
‑
3'。
[0008]本专利技术第二方面提供一种上述的用于检测肿瘤细胞内microRNA
‑
203的双光子荧光纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1、合成双光子硅纳米颗粒TP
‑
SiNPs；
[0010]S2、发夹DNA1修饰双光子硅纳米颗粒制备TP
‑
SiNPs@H1；
[0011]S3、在发夹DNA2上修饰羧基荧光素FAM，得到H2‑
FAM。
[0012]进一步地，所述步骤S1具体包括：
[0013]S11、将2
‑
萘甲酸添加到的含有DIPEA和HATU的DMF中，在冰浴中反应0.5
‑
1.5小时，加入APTES并在室温下搅拌1
‑
2小时；
[0014]S12、将步骤S11得到的混合物倒入冰水中，产生沉淀，沉淀经真空过滤机分离，硅胶柱层析纯化，得到固体粗产物；
[0015]S13、将TEOS溶解在乙醇中，逐滴加入步骤S12得到的固体粗产物中，再滴加三乙醇胺，搅拌反应1
‑
2小时，离心收集反应物并用乙醇洗涤数次；
[0016]S14、将步骤S13得到的反应物溶解在乙醇中，加入戊二酸酐，搅拌3
‑
5小时，离心并洗去未反应的戊二酸酐，冷冻干燥得到双光子硅纳米颗粒TP
‑
SiNPs。
[0017]进一步地，所述步骤S2具体包括：
[0018]S21、将EDC和sulfo
‑
NHS添加到含有双光子硅纳米颗粒TP
‑
SiNPs的MES缓冲液，反应8
‑
12小时，超滤离心除去过量的EDC和sulfo
‑
NHS，得到羧基活化的TP
‑
SiNPs；
[0019]S22、将羧基活化的TP
‑
SiNPs分散在HEPES缓冲液中，并与H1混合，在3
‑
7℃下反应40
‑
56小时；
[0020]S23、用Tris缓冲液超滤离心清洗数次，得到发夹DNA1修饰双光子硅纳米颗粒TP
‑
SiNPs@H1。
[0021]进一步地，所述步骤S3具体包括：
[0022]得到发夹DNA2后，将C6
‑
dT amino
‑
linker加到胸腺嘧啶残基上，修饰后氨基与主链相距10个原子，通过有机合成的方法将羧基荧光素FAM标记在发夹DNA2的序列上，得到H2‑
FAM。
[0023]进一步地，发夹DNA1和发夹DNA2通过亚磷酰胺三酯法合成，合成的方向为：待合成引物的3
’
端向5
’
端合成，相邻的核苷酸通过3
’‑5’
磷酸二酯键连接。
[0024]本专利技术第三方面提供一种上述的用于检测肿瘤细胞内microRNA
‑
203的双光子荧光纳米探针在组织成像/活体成像中的应用
[0025]综上所述，本专利技术的有益本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肿瘤细胞内microRNA
‑
203的双光子荧光纳米探针，其特征在于，包括双光子硅纳米颗粒、羧基荧光素和发夹结构DNA，所述双光子硅纳米颗粒上修饰了发夹DNA1，发夹DNA2上修饰了所述羧基荧光素，所述双光子硅纳米颗粒作为能量供体，所述羧基荧光素作为荧光受体。2.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤细胞内microRNA
‑
203的双光子荧光纳米探针，其特征在于，所述发夹DNA1的序列为：5'
‑
TTT AGG ACC ACT AGG GTG TGT GTG GGC TAG TGG TCC TAAACATTTCAC
‑
NH2‑
3'，所述发夹DNA2的序列为：5'
‑
GGT GTG TGT GGG(T
‑
FAM)TTA GGACCACTAGCC CAC ACA CAC CCT AGT GGT
‑
3'。3.一种如权利要求1或2所述的用于检测肿瘤细胞内microRNA
‑
203的双光子荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、合成双光子硅纳米颗粒TP
‑
SiNPs；S2、发夹DNA1修饰双光子硅纳米颗粒制备TP
‑
SiNPs@H1；S3、在发夹DNA2上修饰羧基荧光素FAM，得到H2‑
FAM。4.根据权利要求3所述的用于检测肿瘤细胞内microRNA
‑
203的双光子荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：S11、将2
‑
萘甲酸添加到的含有DIPEA和HATU的DMF中，在冰浴中反应0.5
‑
1.5小时，加入APTES并在室温下搅拌1
‑
2小时；S12、将步骤S11得到的混合物倒入冰水中，产生沉淀，沉淀经真空过滤机分离，硅胶柱层析纯化，得到固体粗产物；S13、将TEOS溶解在乙醇中，逐滴加入步骤S12得到的固体粗产物中，再滴加三乙醇胺，搅拌反应1
‑
2小时，离心收集反应物并用乙醇洗涤数次；S14、...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴永祥，何康迪，喻盛容，钟红梅，刘荧，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：