PCTR1在促进中性粒细胞反向迁移加速炎症消退中的应用制造技术

本发明专利技术公开了PCTR1在促进中性粒细胞反向迁移加速炎症消退中的应用，该应用通过简化损伤部位的中性粒细胞反向迁移的路径促进中性粒细胞反向迁移；且PCTR1采用的浓度为100nM。该应用中对生物基因表达情况和细胞凋亡、细胞增殖情况均无不良影响；能够减少中性粒细胞聚集时间，减少在损伤部位再引起组织损伤；能够促进损伤部位中性粒细胞的反向迁移，并促进损伤的修复。伤的修复。伤的修复。

【技术实现步骤摘要】
PCTR1在促进中性粒细胞反向迁移加速炎症消退中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体为PCTR1在促进损伤部位中性粒细胞反向迁移加速炎症消退中的应用。

技术介绍

[0002]中性粒细胞在先天免疫反应中发挥着重要的生理作用。中性粒细胞可以杀死和隔离进入该部位的微生物，但也会引起组织损伤，故中性粒细胞在完成其作用后，必须及时从炎症部位清除，才能恢复组织稳态。中性粒细胞凋亡后巨噬细胞吞噬，这是中性粒细胞从炎症部位清除的最重要机制。但近年来人们发现，中性粒细胞离开炎症部位返回周围组织或血管系统的反向迁移也是一种可以消除炎症的促消退机制。而开发内源性促消退方式有望成为一种潜在的治疗方法。
[0003]斑马鱼已成为毒理学和人类疾病研究的一种替代体内模型。特别是，胚胎
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幼虫期(受精后长达五天)代表了一个简单但复杂的整体动物模型，具有体外细胞培养模型的适用性。这一时期呈现出若干特征，并被证实与啮齿动物的类似研究具有良好的相关性。机体可以产生一系列内源性特异性促炎症介质(SPM)，精确调节炎症消退过程。
[0004]PCTR1是一种SPM，可通改善ARDS肺水肿的液体清除，也可以改善LPS诱导的急性炎症和多器官损伤，还可以促进皮肤伤口修复和细菌清除。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种PCTR1在促进损伤部位中性粒细胞反向迁移加速炎症消退中的应用方案。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：PCTR1在促进中性粒细胞反向迁移加速炎症消退中的应用。
[0007]具体的，该应用通过简化损伤部位的中性粒细胞反向迁移的路径促进中性粒细胞反向迁移。
[0008]具体的，该应用中PCTR1采用的浓度为100nM。
[0009]本专利技术的有益效果：
[0010]1.对生物基因表达情况和细胞凋亡、细胞增殖情况均无不良影响；
[0011]2.能够减少中性粒细胞聚集时间，减少在损伤部位再引起组织损伤；
[0012]3.能够促进损伤部位中性粒细胞的反向迁移，并促进损伤的修复。
附图说明
[0013]图1为损伤部位中性粒细胞聚集示意图，(A：斑马鱼损伤部位中性粒细胞募集形态学图片；B：斑马鱼损伤部位中性粒细胞计数图(**P＜0.01剪尾6h VS剪尾0h；##P＜0.01剪尾6h VS剪尾2h；&&P＜0.01剪尾6h VS剪尾8h))；
[0014]图2为不同浓度的PCTR1促进24小时炎症部位中性粒细胞数量的下降效果示意图
(*P＜0.05PCTR1 50nM VS PCTR1 100nM、PCTR1 200nM)；
[0015]图3为不同剂量的PCTR1对斑马鱼幼鱼行为学的影响结果示意图；
[0016]图4为不同剂量的PCTR1对斑马鱼体内细胞凋亡的影响结果示意图；
[0017]图5为不同剂量的PCTR1对斑马鱼体内细胞增殖的影响结果示意图；
[0018]图6为PCTR1 100nM促进斑马鱼幼鱼剪尾后损伤部位24小时中性粒细胞减少效果示意图(**P＜0.01 24h Control VS 24h PCTR1 100nM)；
[0019]图7为PCTR1 100nM对损伤部位组织修复和死亡率的影响效果示意图(**P＜0.01Control VS PCTR1 100nM)；
[0020]图8为PCTR1 100nM作用原理示意图；
[0021]图9为PCTR1 100nM更具体的作用原理示意图。
具体实施方式
[0022]下面将结合附图所给出的实施例对本专利技术做进一步的详述。
[0023]参照图1
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9所示，
[0024]一、斑马鱼饲养和胚胎收集及暴露
[0025]在本研究中使用了野生型AB线斑马鱼和在髓过氧化物酶启动子
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Tg(MPO:EGFP)下表达EGFP的斑马鱼转基因线。所有斑马鱼均购自中国科学院水生生物研究所国家斑马鱼资源中心。斑马鱼的护理和使用是根据温州医科大学动物护理和使用机构委员会批准的既定指南进行的。根据标准斑马鱼育种协议(Westerfield，1995)，将成年斑马鱼饲养在28℃的标准实验室条件下，光照周期为14：10(光：暗)，在一个循环系统中饲养。斑马鱼胚胎取自产卵成鱼，雌雄比为1：1。在产卵0.5h内收集胚胎，用纯水将胚胎洗干净，换胚胎培养液EM，放入光照周期为14Ligth：10Dark的28℃光照恒温培养箱中培养。胚胎发育到8hpf，去除未受精和发育异常的胚胎，将正常发育的健康胚胎挑选到24孔板中，每孔10枚，每孔加相应的浓度1mL进行PCRT1的暴露。对照组加EM。
[0026]二、斑马鱼幼虫中的PCTR1
[0027]处理PCTR1以100μg/ml的浓度溶解在乙醇中作为储备溶液。PCTR1的分子量为649.8。PCTR1分装为1μg/10μl，吹氮后用PBS重悬100μl，即1μg/100μl为原液浓度。我们需要的三个浓度分别为50nM、100nM和200nM。将3.25μl、6.5μl和13μl pctr1原液添加到1ml培养基中以制备50nM、100nM和200nM PCTR1。本实验采用孵育法。切尾后6小时，将PCTR1以不同的终浓度添加到斑马鱼培养基中。
[0028]三、斑马鱼白化幼鱼基因表达
[0029]3.1胚胎RNA的提取
[0030](1)样品保存：待斑马鱼发育至48hpf/5dpf，取40枚胚胎/30条幼鱼置于1.5mL EP管中；加200μL Trizol，搅拌器充分搅碎，再加800μL Trizol，轻轻混匀，室温静置8min，立即置于
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80℃超低温冰箱保存过夜。
[0031](2)室温解冻完全后，涡旋混匀，12000rpm、4℃条件下离心10min；取上清，加200μL氯仿，上下颠倒混匀，室温静置8min，4℃、12000rpm离心15min。
[0032](3)取上清至新的1.5mL EP管中(不要碰到下层液体)，再加等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，静置7min，4℃、12000rpm离心10min。
[0033](4)弃上清，沉淀为RNA，用DEPC水配制的75％酒精清洗RNA沉淀，4℃、12000rpm离心5min。重复1次，去除75％酒精，置于超净工作台内室温干燥30min。
[0034](5)加20μL DEPC水溶解RNA，用Nanodrop测RNA浓度(A260/280在1.9
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2.1之间)；凝胶电泳检测RNA完整性。
[0035]3.2逆转录cDNA的合成
[0036]冰上溶解所需试剂，混匀后进行逆转录，逆转录cDNA体系中RNA量为1μg，最终获得的cDNA浓度为50ng/μL。(逆转录试剂是诺唯赞生物科技有限公司)<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PCTR1在促进中性粒细胞反向迁移加速炎症消退中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该应用通过简化损伤部位中性粒细胞反...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅虹霞，张艺萱，许祺超，赵文琦，严明阳，陈曦，娄城豪，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：