一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用技术

本申请公开了一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用。本申请的RSPO1检测稳转细胞株为人胚胎肾细胞De

【技术实现步骤摘要】
一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]R
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脊椎蛋白(R
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Spondin，RSPO)蛋白家族是含有血小板反应蛋白质1型重复序列(thrombospondin type1 repeat,TSR
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1)的超家族。其家族有4个成员，分别为R
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spondin1～4(RSPO 1～4)；它们的氨基酸序列同源性为40％～60％，且均含有1个羧基尾巴和2个富含半胱氨酸的弗林蛋白质酶域(furin
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like cysteine
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rich domains,FLD)。RSPOl被认为是一种崭新的内皮细胞分裂素，能够刺激黏膜的生长。实验显示，由DSS、TNBS等药物在小鼠肠道引发的急性或慢性炎症，可以通过注射RSPOl蛋白来改善，RSPOl通过调节Wnt/β
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catemin信号通路刺激隐窝上皮细胞生长和黏膜再生以保持黏膜完整性，令肠道结构得到修复，从而使炎症带来的小鼠体重减轻、腹泻、直肠出血等症状得到减轻。与此相似的是，肿瘤小鼠在接受化学治疗或放射治疗时，RSPO同样可以通过刺激内皮细胞增殖使化疗药物和放射物对黏膜造成的损伤得到修复，从而保护正常组织免受毒副作用的影响，提示RSPO具有作为抗癌辅助药物的潜力。以上发现暗示RSPO在某些肿瘤的治疗中具有相当的潜力，有望成为新型的抗肿瘤基因治疗药物。
[0003]另有研究报道，RSPOl及其同源蛋白可作为配体特异性激活孤儿受体LGR5，并激活Wnt信号通路。而Wnt/β
‑
catenin信号通路在细胞极性产生和细胞命运决定中发挥重要作用，包括通过干细胞群体进行的自我更新，进而影响生物体的组织分化，器官形成以及疾病发生。近年来，随着干细胞培养技术，特别类器官培养技术的兴起，RSPO
‑
1作为培养基中的主要组成部分，也愈发凸显其重要性。
[0004]RSPO1的蛋白表达和纯化是满足其在干细胞培养和组织修复应用的必要途径。但纯化后的蛋白活性的定性和定量检测仍存在诸多问题：1)缺少特异性响应RSPO1的靶向序列；2)瞬时转染的细胞批次不稳定，影响RSPO1的定量检测。本专利技术构建了一株能够检测RSPO1稳定表达的细胞株，可以稳定的测试RSPO1蛋白的活性，为RSPO1的应用提供了技术保障。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用，解决了上述
技术介绍
中的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种RSPO1检测稳转细胞株，命名为人胚胎肾细胞De
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RSPO
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CS，于2022年1月20日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202224，地址为中国武汉，武汉大学。
[0008]本专利技术提供的人胚胎肾细胞De
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RSPO
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CS是通过以下方法进行构建：
[0009]S1.慢病毒载体pHS
‑
AVC进行线性化处理后与测试RSPO1活性的元件序列进行连接形成终载体；
[0010]S2.终载体进行病毒包装，形成过表达慢病毒包装产物；
[0011]S3.过表达慢病毒包装产物感染293FT细胞，筛选，即得到RSPO1检测稳转细胞株。
[0012]本专利技术还提供了人胚胎肾细胞De
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RSPO
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CS的子代细胞。
[0013]本专利技术还提供了人胚胎肾细胞De
‑
RSPO
‑
CS及其子代细胞的用途，包含以下一项或多项：
[0014]a.用于RSPO1蛋白功能测试；
[0015]b.用于研究Wnt信号通路相关分子机制；
[0016]c.用于开发或测试Wnt相关拮抗剂/激动剂的药物。
[0017]本专利技术技术效果如下：
[0018]1.本专利技术成功建立了稳定检测RSPO1蛋白活性的稳转细胞株，为RSPO1蛋白功能机制研究提供了一种新的研究工具。
[0019]2.本专利技术构建RSPO1检测稳转细胞株所用的质粒，以慢病毒质粒pHS
‑
AVC为骨架，在其多克隆位点插入TCF/LEF结合位点序列,微小启动子序列(Minimal TA promoter)，以及荧光检测蛋白Luciferase CDS序列，可以灵敏的检测Wnt信号通路中β
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catenin介导的TCF/LEF转录活性水平。
[0020]3.本专利技术构建RSPO1检测稳转细胞株相比瞬时转染方式所获的细胞在蛋白测试方面具有更加稳定性的优势，解决了测试批次间的差异。
[0021]4.本专利技术构建RSPO1检测稳转细胞株细胞形态更加饱满，呈现长纤维状。分裂旺盛，可连续传代，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿，构建的细胞系稳定性好。
附图说明
[0022]图1 RSPO1检测稳转细胞株构建过程图
[0023]图2 RSPO1检测稳转细胞株构建的骨架载体图谱
[0024]图3终载体酶切验证结果图
[0025]图4慢病毒包装流程图
[0026]图5稳转细胞株筛选图
[0027]图6稳转细胞株测试商品化的RSPO1蛋白定性结果
[0028]图7稳转细胞株测试RSPO1蛋白的标准曲线及未知浓度的定量计算结果
具体实施方式
[0029]为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本专利技术保护范围的限制，任何在本专利技术基础上做出的改变和变化，都在本专利技术的保护范围之内。
[0030]主要仪器及生产商
[0031]仪器名称生产厂家Sorvall Legend Mircro 17台式离心机美国ThermoFisher公司Sorvall ST 16R冷冻离心机美国ThermoFisher公司
微量移液器德国Eppendorf公司生物安全柜新加坡ESCO公司EVOS荧光显微成像系统美国ThermoFisher公司恒温二氧化碳细胞培养箱德国Binder公司实验室耗材I(移液枪头、1.5/2.0mL离心管)美国Axygen公司实验室耗材II(细胞培养皿、移液管等)美国Corning公司超低温冷冻冰箱美国ThermoFisher公司凝胶成像分析系统北京赛智创业科技有限公司凝胶电泳系统美国BioRad公司
[0032]主要试剂及生产商
[0033]仪器名称生产厂家质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型)北京艾德莱生物科技有限公司限制性内切酶类美国NEB公司/美国ThermoFisher公司DNA L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RSPO1检测稳转细胞株，其特征在于，所述RSPO1检测稳转细胞株为人胚胎肾细胞De
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RSPO
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CS，于2022年1月20日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202224。2.如权利要求1所述的人胚胎肾细胞De
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RSPO
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CS细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：S1.慢病毒载体pHS
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AVC进行线性化处理后与测试RSPO1元件序列进行连接形成终载体；S2.所述终载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴万军，余磊，陈洁琳，余建辉，黄奕锟，
申请(专利权)人：深圳明澳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：