【技术实现步骤摘要】
基于显色原理的致病性大肠杆菌模型及其快速检测方法
[0001]本专利技术涉及大肠杆菌检测
，具体涉及一种基于显色原理的致病性大肠杆菌模型及其快速检测方法。
技术介绍
[0002]当前纺织品微生物检测主要依据国家强制性标准GB 15979，在该标准中，采用平板培养法检测微生物的数量，耗时48h，检测时间长；即便对近年来临床感染病例数排名第一的致病性大肠杆菌，采用检测特定微生物的产气法，也至少需要24h才能出结果。耗时长，还会给检测人员带来潜在的感染风险。
[0003]国内微生物检测目前依据平板培养法作为“金标准”，检测时间长、操作略微复杂；国外微生物检测主要依据免疫分析法、分子生物学法以及近些年来发展起来的质谱法。免疫分析法主要利用抗体与微生物表面具有免疫原性的区域发生特异性识别来实现检测，包括酶联免疫分析法、免疫层析法等，但是该方法存在抗体制备批次间差异大、稳定性不够理想，免疫层析精密度较差等缺陷；分子生物学法主要通过聚合酶链式反应(PCR)来进行菌种鉴定，方法特异性好，但PCR反应易受气溶胶污染，检测需在特定...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.基于显色原理的致病性大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S00、将羧基磁珠与含有大肠杆菌O157:H7的适配体序列进行偶联；将富含鸟嘌呤序列的DNA组装形成G
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四联体DNA酶，再与该含有大肠杆菌O157:H7的适配体序列进行杂交构建大肠杆菌O157:H7生物传感器；S10、用不同已知浓度的大肠杆菌O157:H7标准样品与含有该大肠杆菌O157:H7生物传感器的溶液进行孵育反应；S20、磁分离吸附移取上清液；S30、上清液中加入适量的显色剂与氧化剂引发显色反应后中止显色反应；S40、记录波长450nm下不同浓度大肠杆菌O157:H7标准样品所对应的吸光度并汇总得到吸光度数据；S50、依据吸光度数据建立反应标准曲线；S60、将待测样品重复步骤S10至S40步骤，得到该待测样品的待测样品吸光度，将该待测样品吸光度带入所述反应标准曲线得到待测样品中大肠杆菌O157:H7的浓度。2.根据权利要求1所述的基于显色原理的致病性大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，步骤S00中，将羧基磁珠与含有大肠杆菌O157:H7的适配体序列进行偶联的具体步骤为：S01、通过偶联缓冲液清洗羧基磁珠多次，将羧基磁珠稀释至5mg/mL；S02、用偶联缓冲液溶解EDC与Sulfo
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NHS，按照1mg磁珠加入20
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50μg的EDC、Sulfo
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NHS的比例，在室温下对羧基磁珠进行活化15
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45min直至活化结束；S03、用偶联缓冲液洗去未反应的物质，然后将磁珠稀释至5mg/mL；S04、用高压灭菌后的去离子水溶解大肠杆菌适配体至1μM，按照1mg磁珠加入1
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10nmol的大肠杆菌O157:H7适配体的比例，进行偶联反应，室温下反应直至反应结束；S05、磁分离弃上清，加入封闭缓冲液封闭2
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4小时，弃上清，再用封闭缓冲液重悬至羧基磁珠浓度为5mg/mL，备用。3.根据权利要求2所述的基于显色原理的致病性大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，步骤S00中，富含鸟嘌呤序列的DNA组装形成G
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四联体DNA酶的具体步骤为：S06、用20mM Tris缓冲液溶解富含鸟嘌呤序列至100nM，95度变性多分钟，缓慢降至室温；S07、加入氯化钾溶液及血红素溶液，孵育多小时，完成G
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四联体DNA酶的组装。4.根据权利要求3所述的基于显色原理的致病性大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，步骤S00中，G
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四联体DNA酶与该含有大肠杆菌O157:H7的适配体序列进行杂交构建大肠杆菌O157:H7生物传感器的具体步骤为：S08、取步骤S05中制得的5mg/mL羧基磁珠溶液，加入5
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50nmol步骤S07中的G
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四联体DNA酶，室温下杂交；S09、杂交完毕后，磁分离弃上清，再用封闭缓...
【专利技术属性】
技术研发人员：邬期望，叶翔宇，刘芙蓉，潘夏俊，斯超，袁昊旻，严方平，
申请(专利权)人：浙江省轻工业品质量检验研究院，
类型：发明
国别省市：
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