一种分析样品中唾液酸含量的高效液相色谱法制造技术

本发明专利技术公开了一种分析样品中唾液酸含量的高效液相色谱法，所述方法包括将乙酸与所述蛋白样品混合获得混合液，以使所述蛋白样品中的唾液酸释放。本发明专利技术解决了现有的分析技术中分光光度法的特异性不强，薄层法的重复性差，质谱法的成本高等问题，从而提供一种简单、特异性强而且准确度高的高效液相色谱法来分析不同类型抗体中唾液酸含量。不同类型抗体中唾液酸含量。

【技术实现步骤摘要】
一种分析样品中唾液酸含量的高效液相色谱法


[0001]本专利技术涉及化学物质检测领域，具体涉及一种分析样品中唾液酸含量的高效液相色谱法。

技术介绍

[0002]双特异性抗体、抗体药物偶联物、糖基工程抗体和纳米抗体等新型工程抗体等新理论新技术不断涌现。抗体药物多通过哺乳动物细胞表达，基因翻译后正确的折叠、空间构象以及修饰决定了抗体药物的正常功能。因此控制翻译后修饰的变异体的种类及数量是抗体药物研发过程面临的巨大挑战之一。抗体药物中糖链的质量占整个抗体分子的2％，对于治疗自体免疫疾病的单克隆抗体，糖链末端的唾液酸修饰的数量可能与其抗炎效果存在强烈的正相关。最常见的是N
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乙酰基神经氨酸，唾液酸的物理分析方法很多，有分光光度法、薄层层析法、高效液相色谱法、核磁共振法和高效液相色谱质谱联用技术等。然而，分光光度法的特异性不强，薄层法的重复性差，质谱法的成本高。
[0003]目前，现有技术例如利用岛津超高效液相色谱仪LC
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30A建立了测定抗体中唾液酸N
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乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N
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羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)含量的分析方法(https://www.instrument.com.cn/application/Solution
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895694.html)。但是该技术中使用的三氟乙酸具有酸解不充分现象或影响衍生化反应的现象，后续检测结果不够准确。
[0004]因此，亟待研究一种简单、特异性强而且准确度高的高效液相色谱法来分析不同类型抗体中唾液酸含量。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是现有的分析技术中特异性不强、重复性差，成本高等问题，从而提供一种分析样品中唾液酸含量的高效液相色谱法。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种测定蛋白样品中唾液酸的方法，所述方法包括以下步骤：
[0007]A)将乙酸与所述蛋白样品混合获得混合液，以使所述蛋白样品中的唾液酸释放；优选所述方法还包括：
[0008]B)将所述混合液进行孵育，获得孵育液。
[0009]在某一具体实施例中，所述乙酸的浓度为3
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5M，所述乙酸与所述蛋白样品的比例为1:1，所述孵育的温度为80℃，所述蛋白样品来自阿达木单抗例如修美乐。
[0010]在某一具体实施例中，所述乙酸的浓度为4M；所述唾液酸为Neu5Ac和/或Neu5Gc。
[0011]在某一具体实施例中，在所述混合之前还包括：
[0012](1)将蛋白样品进行换液处理，所述换液使用缓冲液例如PBS洗涤例如4次，所述换液使用超滤管，获得换液后的蛋白样品。
[0013]在某一具体实施例中，在所述孵育之后还包括：
[0014]C)加入DMB溶液，混匀，反应例如2.5h；
[0015]在某一具体实施例中，所述DMB溶液的浓度为13mM，所述孵育液和所述DMB的比例为1:1，所述C)中反应的条件为避光，温度为50℃。
[0016]在某一具体实施例中，所述DMB溶液为含有1.5M乙酸，14mM连二亚硫酸钠，0.8M 2
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巯基乙醇，13mM DMB。
[0017]在某一具体实施例中，所述方法中使用高效液相色谱法进行检测，所述高效液相色谱法使用的液相色谱柱的型号为Thermo Hypersil GoldTM aQ 250。
[0018]在某一具体实施例中，所述液相色谱柱的内径为4.6mm。
[0019]在某一具体实施例中，所述液相色谱柱使用的流动相为7％甲醇，8％乙腈水溶液。
[0020]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。
[0021]本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0022]本专利技术的积极进步效果在于：
[0023]本专利技术采用最优的酸解试剂类型，解决了样品酸解程度不足导致的结果不准确。本专利技术的方法测到的Neu5Ac与Neu5Gc分别在0.0002～0.01g/L和0.0002～0.01g/L浓度范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.999，准确度范围分别在102％～106％与101％～111％之间，已达到解决酸解不充分现象或影响衍生化反应的现象，并有更好的准确度。
附图说明
[0024]图1为Neu5Ac与Neu5Gc标准曲线；图1的A为Neu5Gc在4M乙酸浓度时的标准曲线，图1的B为Neu5Ac在4M乙酸浓度时的标准曲线。
[0025]图2为乙酸条件下，Neu5Ac与Neu5Gc不同浓度的标准曲线叠图。
[0026]图3为修美乐单抗结果图谱。
[0027]图4为不同浓度(2～6M)乙酸处理条件下Neu5Ac与Neu5Gc标准曲线。
[0028]图5为三氟乙酸条件下，Neu5Ac与Neu5Gc不同浓度的标准曲线叠图。
具体实施方式
[0029]为对本专利技术的
技术实现思路
、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步详细地描述，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0030]下述实施例中数据均是通过两次平行实验后取平均值得出。
[0031]实施例1
[0032]本实施例中高效液相色谱法分析修美乐单抗生物类似药中唾液酸含量，首先利用乙酸处理释放唾液酸，再通过衍生化试剂标记，具体操作步骤如下：
[0033]步骤1)，取400μg样品至离心管中，再加入PBS补足至400μL。混匀后转移至超滤管，13000rpm，8
±
2℃离心10min。离心后，再用PBS补足体积至刻度400μL，混匀，13000rpm，8
±
2℃离心10min，重复此步骤4次后，加入PBS补足体积至刻度100μL，将超滤管中截留液转至新的离心管中。混匀后使用Nanodrop测定蛋白浓度。
[0034]步骤2)，将25μL 4M的乙酸加入到25μL 1mg/mL标准品(Neu5Ac与Neu5Gc)/蛋白样品(修美乐)，混匀，80℃孵育2小时。
[0035]步骤3)，在上述体系中，加入50μL DMB溶液(1.5M乙酸，14mM连二亚硫酸钠，0.8M 2
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巯基乙醇，13mM DMB)，混匀，黑暗条件下50℃孵育2.5h。冷却至室温装瓶待测。
[0036]步骤4)，制备流动相为7％甲醇，8％乙腈水溶液，安装色谱柱Thermo Hypersil GoldTM aQ 250*4.6mm。
[0037]步骤5)，设置仪器参数：激发波长373nm；发射波长448nm；柱温35
±
2℃；样品室温度8
±
2℃；进样体积20μL；运行模式采用等度模式；流速1.2mL/min；运行时间15minutes。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定蛋白样品中唾液酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：A)将乙酸与所述蛋白样品混合获得混合液，以使所述蛋白样品中的唾液酸释放；优选所述方法还包括：B)将所述混合液进行孵育，获得孵育液。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酸的浓度为3
‑
5M，所述乙酸与所述蛋白样品的比例为1:1，所述孵育的温度为80℃，所述蛋白样品来自阿达木单抗例如修美乐。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乙酸的浓度为4M；所述唾液酸为Neu5Ac和/或Neu5Gc。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述混合之前还包括：(1)将蛋白样品进行换液处理，所述换液使用缓冲液例如PBS洗涤例如4次，所述换液使用超滤管，获得换液后的蛋白样品。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述孵育之后还包括：C)加入DM...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓辉，郑子荣，李程亮，吴俊明，
申请(专利权)人：鼎康武汉生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：