杧果根部钾离子通道基因MiSKOR及表达载体构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了杧果根部钾离子通道基因MiSKOR及表达载体构建方法和应用，杧果K

【技术实现步骤摘要】
杧果根部钾离子通道基因MiSKOR及表达载体构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种杧果根部钾离子通道基因及表达载体构建方法和应用。

技术介绍

[0002]钾离子(K
+
)是植物细胞内含量最为丰富的矿物营养元素，维持细胞电荷平衡、调节细胞渗透势，参与气孔开闭、光合作用、蒸腾作用等多种生命过程，与植物的生长、发育和果实品质密切相关。园艺学中，土壤缺钾严重抑制果树生长发育，影响果实品质、产量和采后贮藏性能，诸多研究主要体现在生理生化层面，果树钾素营养高效与利用的分子机制研究稀缺。
[0003]植物需要通过根部从土壤中吸收所需的K
+
，然后分配到不同器官部位，进而满足正常的生长和发育。植物K
+
营养吸收存在2种机制：机制Ⅰ，高亲和性钾吸收系统，在外界环境K+浓度小于200μmol
·
L
‑1时起主要作用的主动吸钾过程；机制Ⅱ，低亲和性钾吸收系统，在外界环境K
+
浓度大于1mmol
·
L
‑1时起主要作用的被动吸钾过程(Epstein et al.,1963；V
é
ry et al.,2003)。植物体内K
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长距离运输和分配是由定位于细胞质膜的各类K
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通道来介导完成的，根据通道蛋白序列、结构及功能的不同，可分为Shaker家族、TPK家族和其他K
+
通道3大类(Lebaudy etal.,2007)。其中，Shaker类K
+
通道的研究最为透彻，其对底物K
+
的亲和常数为数十毫摩尔，属于典型的低亲和、高通量的K
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通道。根据电压依赖性和K
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在跨膜时的运动方向差异，Shaker型K
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通道可进一步分为内向整流、外向整流和弱向整流(即双向整流)通道。其中，SKOR编码一类外向整流型Shaker型K
+
通道，在植物钾素营养高效方面发挥重要作用。
[0004]目前，果树学中仅有葡萄SKOR的研究报道(沈静沅等，2020)，热带果树作物中尚未见任何有关SKOR通道的报道。因此，从杧果中分离并鉴定新的SKOR 同源基因，可为研究热带果树作物钾素营养高效的分子机制提供理论基础和基因材料，具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种杧果根部钾离子通道基因MiSKOR及高效表达 MiSKOR基因的表达载体构建方法，并提供MiSKOR异源超量表达的转基因拟南芥创制方法以及该基因在提高植物钾素营养高效与抗逆方面的应用。
[0006]本专利技术的技术解决方案是：
[0007]一种杧果根部钾离子通道基因MiSKOR，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示：
[0008][0009][0010]一种杧果根部钾离子通道基因MiSKOR的重组表达载体 pTracer
‑
CMV3
‑
MiSKOR的构建方法，其特征是：设计构建重组质粒的特异引物，其中5
’
端引物引入Kpn I酶切位点，碱基序列为GAGGGTACCA TGGGCGATACTGCAAGAGAG GA，3
’
端引物引入Not I酶切位点，碱基序列为GAAGCGGCCGCTTACAAGCT CTTCAATGGT ATG所示，通过PCR方法扩增克隆杧果MiSKOR 基因CDS片段，并回收PCR产物；分别用Kpn I和Not I双酶切MiSKOR基因的 PCR回收产物和pTracer
‑
CMV3质粒，然后用T4 DNA ligase连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性克隆子，利用质粒小提试剂盒提取质粒，测序验证正确的即为重组表达载体pTracer
‑
CMV3
‑
MiSKOR。
[0011]一种杧果根部钾离子通道基因MiSKOR异源超量表达的转基因拟南芥株系创制方法，其特征是：包括下列步骤：
[0012](1)表达载体pHB
‑
MiSKOR构建
[0013]设计构建重组质粒的特异引物，其中5
’
端引物引入BamH I酶切位点，碱基序列为GAGGGATCCA TGGGCGATAC TGCAAGAGAG GA，3
’
端引物引入XbaI酶切位点，碱基序列为GCGTCTAGAT TACAAGCTCT TCAATGGTAT GC，通过PCR方法扩增杧果MiSKOR基因CDS片段，并回收PCR产物；分别用BamH I和XbaI双酶切MiSKOR基因的PCR回收产物和pHB质粒，然后用T4 DNA ligase连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性克隆子，利用质粒小提试剂盒提取质粒，测序验证正确的即为重组表达载体pHB
‑
MiSKOR；
[0014](2)超表达转基因拟南芥创制
[0015]通过根癌农杆菌介导方法(参照Valvekens等，1988)，将构建的重组表达载体pHB
‑
MiSKOR侵染野生型拟南芥Col
‑
0(购自美国ATCC)的花絮，在含50μg
·
L
‑1卡那霉素的1/2MS平板上筛选抗性纯系苗，鉴定MiSKOR超表达的转基因拟南芥 T1纯系植株。
[0016]一种杧果根部钾离子通道基因MiSKOR在制备提高植物钾素营养高效和抗逆制剂中的应用。
[0017]本专利技术公开了一种杧果K
+
通道基因MiSKOR，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该基因主要在根部特异表达，其表达丰度受高钾环境显著诱导，具有介导 K
+
外向流动和运输的电流特征。
[0018]其次，本专利技术公开了上述杧果K
+
通道基因MiSKOR编码的通道蛋白，其序列如SEQ ID NO：2所示。杧果MiSKOR与其他植物SKOR同源蛋白氨基酸序列具有较高的一致性，氨基酸序列含有离子通道跨膜域(PF00520)、环核苷酸结合域 (PF00027)、ankyrin锚蛋白域(PF12796)和KHA二聚体结构域(PF11834)等功能结构域。
[0019]第三，本专利技术提供了一种含有上述杧果MiSKOR基因的重组表达载体，该重组表达载体为动物表达载体，该动物表达载体包括但不限于载体pTracer
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CMV3。
[0020]第四，本专利技术提供了一种含有上述杧果MiSKOR基因的双元超表达载体，该双元表达载体包括但不限于载体pHB。
[0021]第五，本专利技术提供了基因序列如SEQ ID NO：1所示的杧果K
+
通道基因在提高作物钾素富集与营养高效利用能力中的应用。
[0022]第六，本专利技术提供了基因序列如SEQ ID NO：1所示的杧果K
+
通道基因在提高作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杧果根部钾离子通道基因MiSKOR，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示：ATGGGCGATA CTGCAAGAGA GGAAATAGTT GGAGAGGATT TGTCGGATTC TGGCGATTACGAAGTAGTAG ATTTGAGAGA TAAGATCAAA TCGTCGCGAG GAAGCCGATT TGATTTAATCGCCAATCAGT TGCTACGAAG GCGATACTTC AGCCGTCAAA ATGTTATCAC TGGTTTCCAAGGTCTCCCCA AAACTCTTCT GATCCATCCC GATAACAGTG TGAGTGCACT GTTGACTTTGTGGAAGAAGT GCAGGTGGTA TCAGGCGTGG ACAAAATTCG TACTTATATG GGCACTCTACTCATCCTTCT TTACACCCAT GGAGTTTGCT TTCTTCAGGG GACTTCCAGA GAACCTTTTTATTTTGGACA TTGCCGGACA GTTGGCTTTC CTTCTTGATA TTATTTTGCA GTTTTTTCTTGCCTACAGAG ATAGCCAGAC TTACCGTATG GTTTATAAGC ACACACCCAT TGCTCTCAAGTACTTAAAAT CCAGTTTTAT CATTGATTTA CTGAGTTGTT TCCCTTGGGA TTTAATTTTTAAGGCTAGTG GAAGAAGAGA AGAAGTTAGG TATCTGTTAT GGATTAGGTT ATATCGGGTACGCAAAGTCA TTCAATTTTT CCATAAGTTG GAGAGGGATA TCCGAATCAA TTATCTGTTTACTAGGATTG TGAAACTCAT TGCTGTTGAA CTCTACTGTA CGCACACAGC AGCATGCATCTTTTACTATT TAGCTACCAC CCTTCCTCCT GGAGAAGAGG GATACACATG GATTGGAAGTTTAAAATTGG GTGATTATAG CTACTCAAAT TTCAGAGAGA TTGACCTCTG GCTGCGATACACAACATCTT TGTATTTTGC CATTGTAACC ATGGCCACTG TTGGGTATGG GGATATACATGCAGTCAATC TGAGGGAAAT GATATTTGTA ATGATTTATG TGTCTTTTGA CATGATTCTTGGAGCTTACT TAATTGGTAA CATGACAGCA TTAATTGTAA AAGGATCAAA GACGGAAAGGTTCAGAGATA AAATGGCAGA TGCCATTAAA TACCTGAACA GAAATAGACT TGGGAGGGACATTCGAGACC AGATCAAAGG CCATTTGCGG TTACAGTATG AGAGCAGCTA CACTGAGGCTGCTGCCCTTC AAGATATCCC TGTTTCCATT CGTGCTAAGA TATCCCAGAC TCTATATTTGCCGTACATTG AAAAGGTTTA TCTTTTTAAA GGGTGCTCTT CAGAATTTAT CAATCAGATTGTTATAAGAC TCCATGAGGA ATTTTTTCTC CCTGGAGAAG TGGTGCTGGA GCAGGGAAATGTGGTAGATC AACTTTACTT TGTCTGTCAT GGTGTTCTGG AGGAGGTTGG TGTTGGAGAAGATGGCATGG AAGCTACTGT TTCATATTTA GAACCAAATA GCTCATTTGG AGAGATTTCTATTCTTTGCA ACATTCCTCA GCCTTACACT GTTCGGGTTT GTGAACTATG TAGGGTTCTGCGAATCGATA AACAGTCTTT TGCCAATATC CTTGAGATAT ATTTCTATGA TGGAAGGAAAATATTGACCA ACCTCTTAGA GGGTAAGGAT TCCAATATCC GTATTAAACA GCTGGAGTCAGACATCACAT TTCACATTGC CAAGCATGAA GCAGAACTTG CATTGAGGGT GAATAGTGCAGCTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋志忠，梁美霞，蔺士卓，张悦，黄建峰，高太平，王力敏，张洪霞，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：