一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术提供一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法、试剂盒及其应用，属于合成生物学技术领域。本发明专利技术通过组合表达噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶，报告了一种有效的体内DNA组装方法。在测试了来自不同噬菌体的各种DNA外切酶和连接酶后，最终确定T5DNA外切酶与T4DNA连接酶组合在所有组合中具有最佳的体内DNA组装效率。该方法不仅能够在大肠杆菌细胞中组装短至5bp的同源序列的DNA片段，还可以用于其他细菌，如假单胞菌、乳杆菌、产碱杆菌，甚至是低效同源重组的解脂耶氏酵母，同时，本发明专利技术还提供了用于上述方法的试剂盒，具有可观的应用价值和前景。观的应用价值和前景。观的应用价值和前景。

【技术实现步骤摘要】
一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于合成生物学
，具体涉及一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]本专利技术
技术介绍
中公开的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]分子克隆对于生物医学、生物技术和合成生物学的研究至关重要。随着基因组序列数据的可用性增加和低成本DNA化学合成技术的发展，DNA片段的组装变得比以前更加必要，并且对可靠、简单和高效的DNA组装方法的需求也在不断增长。
[0004]基于短同源末端序列的DNA体外组装是目前最广泛使用的DNA组装技术。这类方法能够在体外酶促混合物中将DNA片段无缝组装到所需的环状质粒中，例如LIC(不依赖连接的克隆)、SLIC(不依赖序列和连接的克隆)、In
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Fusion,Gibson组装和TEDA(T5核酸外切酶DNA组装)。LIC、SLIC和In
‑
Fusion方法都是利用DNA聚合酶的核酸外切酶活性形成单链DNA(ssDNA)，再根据同源序列进行退火，然后DNA聚合酶填充剩余的DNA缺口。更高效的Gibson组装方法是在多酶混合物中利用T5核酸外切酶从5
’
端消化DNA片段，生成用于退火的ssDNA，利用Phusion高保真DNA聚合酶填充DNA缺口，利用Taq DNA连接酶修复DNA缺口。
[0005]尽管体外DNA组装能够有效进行DNA克隆，但这些方法都需要昂贵的酶试剂。相比之下，考虑到成本效益和节省时间的优点，直接在细胞内进行DNA片段的组装更具吸引力。实际上，由于固有的高效同源重组，酿酒酵母细胞已被广泛用于在DNA人工合成过程中将短寡核苷酸在体内组装成大DNA片段。近年来，基于同源重组的体内DNA组装方法在酿酒酵母中迅速扩展。然而，对于大多数微生物，例如实验室常用的大肠杆菌菌株，细胞内重组不如酿酒酵母有效。尽管在大肠杆菌细胞中报道了一些体内DNA组装方法，但它们都没有流行起来，主要原因是效率低并且机制不明确。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中的不足，本专利技术的目的在于提供一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法、试剂盒及其应用。本专利技术通过组合表达噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶，报告了一种有效的体内DNA组装方法(图1)，并将其命名为“噬菌体酶辅助的体内DNA组装(PEDA)”。在测试了来自不同噬菌体的各种DNA外切酶和连接酶后，最终确定T5 DNA外切酶与T4 DNA连接酶组合在所有组合中具有最佳的体内DNA组装效率。该方法不仅能够在大肠杆菌细胞中组装短至5bp的同源序列的DNA片段，还可以用于其他细菌，如假单胞菌、乳杆菌、产碱杆菌，甚至是低效同源重组的解脂耶氏酵母，同时，本专利技术还提供了用于上述方法的试剂盒，因此具有良好的实际应用之价值。基于上述研究成果，从而完成本专利技术。
[0007]本专利技术的第一个方面，提供一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法，所述方法
包括：使用噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶对两个或两个以上核酸分子进行处理，并使之发生同源重组，从而实现在宿主细胞体内的DNA组装。
[0008]所述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶为T5核酸外切酶；
[0009]所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
[0010]所述方法还包括：使用RecA和λ
‑
gam蛋白进行处理以进一步提高上述体内DNA组装效率。
[0011]需要说明的是，上述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶、DNA连接酶、RecA和λ
‑
gam蛋白是重组表达的，从而实现在宿主细胞内的表达或过表达。
[0012]经试验证明，本专利技术的DNA组装方法适用于多种微生物，具有普适性。
[0013]本专利技术的第二个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶或者编码上述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶的核酸。
[0014]其中，所述DNA外切核酸酶为T5核酸外切酶；
[0015]所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶；
[0016]所述试剂盒还包含RecA和λ
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gam蛋白或者编码上述RecA和λ
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gam蛋白的核酸；
[0017]进一步的，所述试剂盒包括表达或过表达上述T5核酸外切酶、T4 DNA连接酶、RecA和λ
‑
gam蛋白的宿主细胞；优选的，所述宿主细胞中包含编码T5核酸外切酶、T4 DNA连接酶、RecA和λ
‑
gam蛋白的核酸。
[0018]所述宿主细胞包括但不限于细菌和真菌，其中所述细菌可以为革兰氏阳性细菌，如大肠杆菌、(植物)乳杆菌等；革兰氏阴性细菌，如(恶臭)假单胞菌、(真养)产碱杆菌等；所述真菌可以为酵母菌，如酿酒酵母、解脂耶氏酵母等。
[0019]所述试剂盒还可以包括一个或多个预先制备的线性载体。
[0020]本专利技术的第三个方面，提供上述方法或试剂盒在DNA合成中的应用。
[0021]上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
[0022]上述技术方案公开了一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装技术，其中组装的关键酶为T5核酸外切酶和T4DNA连接酶，另外过表达促进退火的RecA和抑制大肠杆菌核酸外切酶RecBCD的λ
‑
gam蛋白，可以进一步提高体内组装效率。相对于其他组装方法，上述技术方案具有效率高、成本低、操作简单等特点。本专利技术最低仅需5bp同源臂就能实现DNA片段克隆，与目前常用的40～80bp同源臂相比，降低了引物的设计难度和合成成本。本专利技术可以在恶臭假单胞菌等多种宿主中实现直接克隆。
[0023]综上，上述技术方案建立了一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装技术，其中组装的关键酶为T5核酸外切酶和T4 DNA连接酶，另外过表达促进退火的RecA和抑制大肠杆菌核酸外切酶RecBCD的λ
‑
gam蛋白，体内组装效率提高到了接近105CFU/μg vector DNA。该技术利用最短5bp的同源臂就可以实现DNA片段组装，为目前报道的使用同源臂最短的组装方法，降低了引物合成成本。该技术适用于革兰氏阴性细菌恶臭假单胞菌和真养产碱杆菌、革兰氏阳性细菌植物乳杆菌和真核微生物解脂耶氏酵母等多种微生物，能够在这些微生物中直接进行DNA片段克隆，降低了基因克隆的难度；因此所述工程菌具有可观的应用价值和前景。
附图说明
[0024]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0025]图1为本专利技术PEDA组装过程。首先，引入的线性DNA片段的5'端被T5核酸外切酶降解，此时λ
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种噬菌体酶辅助的体内DNA片段组装方法，其特征在于，所述方法包括：使用噬菌体衍生的DNA外切核酸酶和DNA连接酶对两个或两个以上核酸分子进行处理，并使之发生同源重组，从而实现在宿主细胞体内的DNA组装；所述噬菌体衍生的DNA外切核酸酶为T5核酸外切酶；所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。2.如权利要求1所述的体内DNA片段组装方法，其特征在于，所述核酸分子为两个，包括目标DNA片段和线性克隆载体，所述目标DNA片段和线性克隆载体之间至少存在一段同源臂；所述同源臂的长度为至少5bp、至少10bp、至少20bp、至少30bp、至少40bp、至少50bp、至少60bp、至少80bp、至少100bp，优选为10～80bp；所述核酸分子长度为1
‑
6kb。3.如权利要求1所述的体内DNA片段组装方法，其特征在于，所述DNA组装采用单链退火机制完成。4.如权利要求1所述的体内DNA片段组装方法，其特征在于，所述方法还包括：使用RecA和λ
‑
gam蛋白进行处理。5.如权利要求1所述的体内DNA片段组装方法，其特征在于，噬菌体衍生的DNA外切核酸酶、DNA连接酶、RecA和λ
‑
gam蛋白是重组表达的，从而实现在宿主细胞内的表达或过表达。6.如权利要求1
‑
5任一项所述的体内DNA片段组装方法，其特征在于，所述宿主细胞包括细菌和真菌；优选的，所述细菌为革兰氏阳性...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁庆生，庞庆霄，苏田源，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：