本发明专利技术公开了一种防控烟草青枯病发生的绿肥筛选方法，根据以下公式计算绿肥防控烟草青枯病发生的能力，其中，E为绿肥防控能力，A1为绿肥根系分泌物在离体培养下对青枯病病原菌的抑制率，A2为“限微模拟宇宙系统”盆栽试验下，绿肥对青枯菌的抑制作用，A3为“限微模拟宇宙系统”盆栽试验下，绿肥对青枯病土酶活性的影响，A4为“限微模拟宇宙系统”盆栽试验下，绿肥对青枯病土壤微生物生态多样性的影响。本发明专利技术通过绿肥防控烟草青枯病发生的能力可筛选出符合要求的绿肥，从而能够有效防控青枯病。从而能够有效防控青枯病。从而能够有效防控青枯病。
【技术实现步骤摘要】
一种防控烟草青枯病发生的绿肥筛选方法
[0001]本专利技术涉及一种防控烟草青枯病发生的绿肥筛选方法，属于绿肥筛选
技术介绍
[0002]烟草是我国重要的经济作物之一，我国植烟土壤面积和烟叶产量均居世界首位，适宜的植烟土壤是生产优质烟叶的基础。贵州省气候和地形都适宜优质烟叶的生产，成为我国烟叶生产第二大省，烤烟产量约占有全国总产量的1/6，烟草种植过程中化肥农药的长期过量投入和经济作物的单一连作，导致土壤生态环境失衡，特别是造成植烟土壤微生物的种群失调，烟草青枯病频发。
[0003]烟草青枯病是一种由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum,简称青枯菌)引起的毁灭性的土传性病害。烟草青枯病是贵州省烟田土传病害危害最深、防控难度最大的病害，仅2015年烟草青枯病对贵州产区造成的产量损失率就高达1％，产值损失达到2456万元。青枯菌主要从土壤中侵染作物根系，其在土壤中生存能力强，且土壤中青枯菌的数量与植物青枯病发病率呈显著正相关。烟草青枯病的发生、流行和危害是诸多因素综合作用的结果，对烟草青枯病的研究和防控主要集中在抗性品种选育、化学药剂防控、土壤添加剂防治及改善栽培管理等方面，但防控效果都不理想。
[0004]在目前贵州植烟土地流转的制度下，烟农对使用有机肥的积极性不高。绿肥以其生产成本低、功能多样、消除连作障碍和防控土传病害靠墙产特点成为烟叶生产中的“新宠”，近年来越来越受到烟农的青睐。作为土壤碳输入的主要措施之一，绿肥翻压对土壤土传病原菌和微生物群落调控的研究甚少，对种植何种绿肥可以有效防控青枯病这一问题也没有系统的研究。
技术实现思路
[0005]基于上述，本专利技术提供一种防控烟草青枯病发生的绿肥筛选方法，以克服现有技术的不足。
[0006]本专利技术的技术方案是：一种防控烟草青枯病发生的绿肥筛选方法，根据以下公式计算绿肥防控烟草青枯病发生的能力，
[0007][0008]其中，E为绿肥防控能力，A1为绿肥根系分泌物在离体培养下对青枯病病原菌的抑制率，A2为“限微模拟宇宙系统”盆栽试验下，绿肥对青枯菌的抑制作用，A3为“限微模拟宇宙系统”盆栽试验下，绿肥对青枯病土酶活性的影响，A4为“限微模拟宇宙系统”盆栽试验下，绿肥对青枯病土壤微生物生态多样性的影响。
[0009]可选的，所述A1的获取方法如下：
[0010](1)将绿肥种子消毒，装入育苗盒中，育苗盒中填满灭菌后的石英砂，待种子萌发2
‑
3d后在盆底加入灭菌的霍格兰营养液，定期灌水保持此水量，放置于恒温光照培养箱28
℃下培养至绿肥根系发达；
[0011](2)先用自来水冲洗掉基质，然后用超纯水润洗根部三次以上，加适量超纯水于育苗盒底部，在恒温光照培养箱28℃下培养48小时，得到绿肥根系分泌物；
[0012](3)将绿肥根系分泌物与TTC液体培养基50倍稀释液混合，将青枯病病原菌茄科劳尔氏菌接种于TTC液体培养基中培养48h后，以5％接种于以上混合液中，放入30℃，170r/min的摇床振荡培养48h后，用分光光度计分别测定OD600；
[0013](4)计算绿肥根系分泌物对青枯病病原菌的抑制率A1，
[0014]A1＝[(CKOD600
‑
ROD600)/CKOD600]×
100％
[0015]其中，ROD600表示在根系分泌物与培养液混合液中的OD600值，CKOD600表示在50倍TTC液体培养液中的OD600值。
[0016]可选的，“限微模拟宇宙系统”盆栽试验的方法如下：
[0017]将青枯病爆发过的土壤过筛后装入微型培养杯中，将动态单向透析管装置置于微型培养杯中部位置，土壤含水率调至15％～20％，向透析管加入绿肥根系分泌物溶液后，盖上非透性微生物膜，置于人工气候箱内，模拟自然环境，设定温度、湿度、光照强度、光照时间和黑暗时间，对照添加灭菌超纯水，每隔设定时间添加一定的溶液，根系分泌物释放后采集紧贴透析管的土壤检测。
[0018]可选的，所述A2的获取方法如下：
[0019]土壤DNA采用Soil DNA Isolation Kit(Omega)提取，采用荧光定量PCR法检测土壤中的青枯菌，土壤中青枯菌的数量表示为lg(copies/g soil)，绿肥对青枯菌的抑制作用A2；
[0020]A2＝[(lg CK
‑
lg G)/lg CK]×
100％
[0021]式中，CK为添加等量灭菌超纯水对照土壤，G为透析管加入绿肥根系分泌物溶液土壤。
[0022]可选的，所述A3的计算方法如下：
[0023][0024]其中，UE为参与土壤碳、氮循环的脲酶，ACP为参与土壤碳、氮循环的酸性磷酸酶，SC为参与土壤碳、氮循环的蔗糖酶，CAT为与土壤氧化还原能力有关的过氧化氢酶，PAL为与烟叶品质相关的苯丙氨酸解氨酶，CKUE为添加等量灭菌超纯水对照土壤的脲酶活性，CKACP为添加等量灭菌超纯水对照土壤的酸性磷酸酶活性，CKSC为添加等量灭菌超纯水对照土壤的蔗糖酶活性，CKCAT为添加等量灭菌超纯水对照土壤的过氧化氢酶活性，CKPAL为添加等量灭菌超纯水对照土壤的苯丙氨酸解氨酶活性。
[0025]可选的，所述A4的获取方法如下：
[0026]在已灭菌的水中加入动态单向透析管紧邻土壤，置于摇床进行震荡培养，震荡完成后置于超净台静置，取上清液稀释，混匀，点样于EcoPlateTM上，放入Omnilog PM高通量微生物细胞表型芯片测定系统培养，培养完成后，对原始数据进行处理，计算微生物多样性指数Shannon Index；
[0027]Shannon Index＝
‑
ΣPi lnPi
[0028]式中，Pi为样品中属于第i种的个体的比例；
[0029]计算表征土壤微生物生态多样性的A4；
[0030]A4＝Shannon Index/CK
‑
Shannon Index
[0031]式中，CK为添加等量灭菌超纯水对照土壤。
[0032]本专利技术的有益效果是：本专利技术通过绿肥防控烟草青枯病发生的能力可筛选出符合要求的绿肥，从而能够有效防控青枯病。
[0033]本专利技术通过不同种类绿肥对青枯病防控效果不同这一现象出发，从根系分泌物对微生物趋避作用筛选有效防控烟草青枯病的绿肥，探索并验证绿肥作为构建健康土壤微生物群落手段能否有效实现土传病害的防控，从而为生物防控烟草土传病害提供新的手段和方法。
附图说明
[0034]图1四种绿肥根系分泌物收集；
[0035]图2“限微模拟宇宙系统”模拟根系分泌物自然释放；
[0036]图3不同绿肥根系分泌物对青枯菌生长的影响；
[0037]图4绿肥对土壤青枯菌数量的影响；
[0038]图5根系分泌物主要单质物质对土壤主要酶活的影响；
[0039]图6绿肥防控本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种防控烟草青枯病发生的绿肥筛选方法，其特征在于，根据以下公式计算绿肥防控烟草青枯病发生的能力，其中，E为绿肥防控能力，A1为绿肥根系分泌物在离体培养下对青枯病病原菌的抑制率，A2为“限微模拟宇宙系统”盆栽试验下，绿肥对青枯菌的抑制作用，A3为“限微模拟宇宙系统”盆栽试验下，绿肥对青枯病土酶活性的影响，A4为“限微模拟宇宙系统”盆栽试验下，绿肥对青枯病土壤微生物生态多样性的影响。2.根据权利要求1所述的绿肥筛选方法，其特征在于，所述A1的获取方法如下：(1)将绿肥种子消毒，装入育苗盒中，育苗盒中填满灭菌后的石英砂，待种子萌发2
‑
3d后在盆底加入灭菌的霍格兰营养液，定期灌水保持此水量，放置于恒温光照培养箱28℃下培养至绿肥根系发达；(2)先用自来水冲洗掉基质，然后用超纯水润洗根部三次以上，加适量超纯水于育苗盒底部，在恒温光照培养箱28℃下培养48小时，得到绿肥根系分泌物；(3)将绿肥根系分泌物与TTC液体培养基50倍稀释液混合，将青枯病病原菌茄科劳尔氏菌接种于TTC液体培养基中培养48h后，以5％接种于以上混合液中，放入30℃，170r/min的摇床振荡培养48h后，用分光光度计分别测定OD600；(4)计算绿肥根系分泌物对青枯病病原菌的抑制率A1，A1＝[(CKOD600
‑
ROD600)/CKOD600]
×
100％其中，ROD600表示在根系分泌物与培养液混合液中的OD600值，CKOD600表示在50倍TTC液体培养液中的OD600值。3.根据权利要求1所述的绿肥筛选方法，其特征在于，“限微模拟宇宙系统”盆栽试验的方法如下：将青枯病爆发过的土壤过筛后装入微型培养杯中，将动态单向透析管装置置于微型培养杯中部位置，土壤含水率调至15％～20％，向透析管加入绿肥根系分泌物溶液后，盖上非透性微生物膜，置于人工气候箱内，模拟自然环境，设定温度、湿度、光照强度、光照时间和黑暗时间，对照添加等量灭菌超纯水，每隔设定时间添加一定...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳霞，李想，付生华，张恒，朱经伟，徐健，李寒，高维常，杨航，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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