用于神经变性障碍的动物模型制造技术

本发明专利技术涉及动物模型，并且特别地涉及用于神经变性障碍，诸如阿尔茨海默病、帕金森病或者运动神经元病的新的体内动物模型。本发明专利技术延伸到用于提供这种模型的方法。本发明专利技术还提供动物模型本身以及用于研究在这种神经变性障碍，特别地阿尔茨海默病中出现的潜在机理的方法，并且还延伸到用于试验药理学试验化合物和筛选药物以用于治疗神经变性疾病的的模型、方法和测定法，所述药理学试验化合物可以调节神经过程。过程。过程。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于神经变性障碍的动物模型
[0001]本专利技术涉及动物模型，并且特别地涉及用于神经变性障碍，诸如阿尔茨海默病、帕金森病或者运动神经元病的新的体内动物模型，并且涉及用于提供这种模型的方法。本专利技术提供了动物模型本身以及用于研究在这种神经变性障碍，特别地阿尔茨海默病中出现的潜在机理的方法，并且延伸到用于试验药理学试验化合物以及用于药物筛选，以用于治疗神经变性疾病的模型、方法和测定法，该药理学试验化合物可以调节神经学过程。
[0002]阿尔茨海默病(AD)是痴呆的最常见形式，但促进这种障碍的主要事件仍旧未被解开。最流行的“淀粉样蛋白质假说”现在正在日益地受到挑战，因此需要与所有临床特征相容的替代性理论。这种不同的一种方法集中于AD中选择性地且主要地易受攻击的神经元的区别特性。它们构成邻近的细胞群的连续中枢，从基底前脑(BF)延伸至中脑和脑干，其将投影发送至几个脑区域，如皮质、海马和嗅球。尽管在易感细胞的这个核心内的递质的异质性，但令人感兴趣的共同特征是它们包含酶，乙酰胆碱酯酶，现已确定其发挥非胆碱能的功能。这种非酶促作用调节钙离子流入神经元，因此，它可以是有营养或者有毒的，这取决于剂量、可用性和神经元年龄。
[0003]乙酰胆碱酯酶(AChE)在发育的不同阶段表达为各种形式，所有的形式都有相同的酶促活性，但是各种形式都具有非常不同的分子组分。“有尾”(T
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AChE)在突触处表达，并且专利技术人之前已经鉴定了两种肽，可以从C
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末端切割这两种肽，一种肽称为“T14”(14聚体肽)，其位于另一种肽内，另一种肽称为“T30”(30聚体肽)，两者与β
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淀粉样蛋白质的可比较区域都具有高度序列同源性。AChE C
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末端肽“T14”已经被鉴定为是AChE分子的沉默部分，负责非水解作用的其范围。合成的14氨基酸肽类似物(即，“T14”)以及随后它被嵌入到其中的更大、更稳定、和更有效的氨基酸序列(即，“T30”)展示了与报道的“非胆碱能的”AChE的作用相似的作用，其中T30序列内的惰性残基(即，“T15”)没有效应。
[0004]目前，没有广泛接受的体内动物模型，该动物模型复现神经变性障碍，诸如阿尔茨海默病(AD)的全部病理学轮廓，因为神经变性的基本机理仍然知之甚少。当前的系统不仅不能够复制疾病的全部临床轮廓，而且可用的系统的大多数依赖于转基因动物来反映仅小百分比的病例具有清楚的遗传基础的疾病。而且，转基因动物的生产非常昂贵，并且需要很长的等待周期使损伤变得明显。因此，迫切需要改进的动物模型或者测定法，其能够实现神经变性疾病的精确研究。
[0005]专利技术人已经研发了一种假说，他们认为该假说解释了表征阿尔茨海默病的异常过程，这是基于α7烟碱性乙酰胆碱受体(α7
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nAChR)与有毒的30
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聚体肽之间的相互作用，从乙酰胆碱酯酶(AChE)的C
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端切割该有毒的30
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聚体肽，即，T30。基于这个假说，它们已经使用体内(即，啮齿动物)模型建立了新的、非转基因的方法，该模型可以用于在比细胞培养物多得更多的生理学场景中研究神经变性障碍。
[0006]因此，专利技术人将单剂量的肽T30施用到大鼠的中间隔膜/基底前脑中，并且研究了在脑的四个不同部分，即，皮质、下皮质、海马和小脑中的有毒的肽(T14)上以及两个阿尔茨海默病标记(τ和Aβ)上的T30介导的修饰。此外，它们还使用免疫组织化学法分析了脑的基底前脑和脑桥/髓质区域，该免疫组织化学法使用抗体进行定量分析。总体目标是首先确定
是否单一剂量的T30可以神经化学地诱导“阿尔茨海默样”的轮廓，该轮廓被定义为与对照比较，治疗组中AD相关的蛋白质的统计学地显著的增加，并且其次确定T30在何种浓度下引起这些变化。图2和3中所示的ELISA结果惊奇地显示，在T30
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肽施用时，总τ蛋白质水平在所有四个脑区域(皮质、下皮质、海马和小脑)中增加了。τ蛋白质是公知的阿尔茨海默病的主要病理学标记，因此在此描述的方法学清楚地证明了T30在四个脑区域中触发阿尔茨海默病样轮廓的作用。此外，如图15所示，与盐水处理的动物比较，在施用T30肽后的大鼠的中脑中观察到NeuN阳性(即，NeuN表达)细胞的密度的显著降低，NeuN阳性细胞是成熟神经元的标记。此外，图15还示出了使用莫里斯(Morris)水迷宫试验，用T30处理的大鼠的行为的恶化。
[0007]当总体考虑数据时，专利技术人坚定地认为这是毒素(即，T30肽)触发在其他正常的野生型啮齿动物的脑中一致的阿尔茨海默样生物化学轮廓的第一证据。在此所述的方法建议用于以时间依赖性和位点特异性方式，监测和操作有助于神经变性的神经化学现象的高度新的体内方法。这种新方法清楚地允许探索在生理学背景下神经变性期间出现的早期阶段，维持研究区域的局部神经元回路，并且给出监测其急性应答的可能性。这种方法学的应用可以用于检查许多分子过程，试验药理学化合物，并且提供用于药物筛选的可靠工具，该药理学化合物可以调节这些过程。
[0008]因此，在本专利技术的第一方面中，提供了一种提供用于神经变性疾病的动物模型的方法，该方法包括将肽引入到非人类的动物的脑中，该肽包含表示为SEQ ID NO：3的氨基酸序列或者其片段的活性变体，或者由其它们组成，其中该肽引起在动物的脑中一个或者多个位点中的τ蛋白质的增加。
[0009]优选地，该方法包括将肽或者其变体或片段引入到野生型非人类的动物的脑中。有利地，专利技术人惊奇地观察到，在将有毒的T30肽施用到野生型(即，换言之，正常的)非人类的动物的脑中之后，在动物的皮质、下皮质、海马和小脑中总τ蛋白质水平增加了。有趣地，专利技术人在施用T30之后，在解剖的脑的任何区域中没有观察到β
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淀粉样蛋白质水平的任何显著差异。然而，先前的研究(Lin等人，2009，J.Alzheimer
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s Dis，18(4)：907
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18)已经确定，CSF中增加的总τ蛋白质，但不是β
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淀粉样蛋白质与阿尔茨海默病的短期记忆损伤相关，并且因此，在此描述的结果与这些早期发现不一致。因此，有利地，本专利技术的方法优选地导致研发τ蛋白质病变的新的动物模型，该τ蛋白质病变表示神经变性障碍或者神经障碍。
[0010]因此，在本专利技术的第二方面中，提供了一种用于神经变性疾病的动物模型，该动物模型是用肽治疗的非人类的动物，该肽包含表示为SEQ ID NO：3的氨基酸序列或者其片段的活性变体，或者由它们组成。
[0011]图3显示了T30肽的施用如何惊奇地导致：(i)动物模型的皮质中τ蛋白质的约40％
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50％增加，(ii)下皮质中τ蛋白质的约175％
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200％增加，(iii)海马中τ蛋白质的约30％
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60％增加；以及(iv)小脑中约160
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180％的增加。专利技术人惊奇的是在施用如此低水平的T30肽(即，1μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种提供用于神经变性疾病的动物模型的方法，所述方法包括将肽引入到非人类动物的脑中，所述肽包含表示为SEQ ID NO：3的氨基酸序列或者其片段的活性变体，或者由它们组成，其中，所述肽引起在动物的脑中一个或者多个位点中的τ蛋白质的增加。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括将肽或者其变体或片段引入到野生型的非人类的动物的脑中。3.根据权利要求1或者权利要求2所述的方法，其中，向所述非人类的动物施用所述肽或者其变体或片段引起在动物的脑中一个或者多个位点中的τ蛋白质的增加，所述位点选自由以下组成的组：皮质、下皮质、海马、小脑、基底前脑、以及脑桥/髓质区域，可选地，其中，所述肽或者其变体或片段的施用引起在动物的脑中至少一个、两个、三个、四个、五个或者所有六个位点中的τ蛋白质的增加，所述位点选自由以下组成的组：皮质、下皮质、海马、小脑、基底前脑、以及脑桥/髓质区域。4.根据任何前述权利要求所述的方法，其中，与未处理的对照比较，所述肽或者其变体或片段的施用引起动物的脑中一个或者多个位点中至少1％、3％、5％、10％或者20％的τ蛋白质的增加。5.根据任何前述权利要求所述的方法，其中，与未处理的对照比较，所述肽或者其变体或片段的施用引起动物的脑中一个或者多个位点中至少30％、40％或者50％的τ蛋白质的增加。6.根据任何前述权利要求所述的方法，其中，向所述非人类的动物施用所述肽或者其变体或片段引起在动物的脑中一个或者多个位点中的神经元的减少，所述位点选自由以下组成的组：皮质、下皮质、海马、小脑、基底前脑、以及脑桥/髓质区域，可选地，其中，所述肽或者其变体或片段的施用引起在动物的脑中至少一个、两个、三个、四个、五个或者所有六个位点中的τ蛋白质的增加，所述位点选自由以下组成的组：皮质、下皮质、海马、小脑、基底前脑、以及脑桥/髓质区域。7.根据任何前述权利要求所述的方法，其中，所述肽或者其变体或片段包含表示为SEQ ID NO：3的序列的至少15、16、17、18或者19个氨基酸，或者由表示为SEQ ID NO：3的序列的至少15、16、17、18或者19个氨基酸组成，或者其中，向非人类的动物的脑施用的所述肽的变体或片段包含表示为SEQ ID NO：3的序列的至少20、21、22、23或者24个氨基酸，或者由表示为SEQ ID NO：3的序列的至少20、21、22、23或者24个氨基酸组成。8.根据任何前述权利要求所述的方法，其中，所述肽或者其变体或片段包含表示为SEQ ID NO：3的序列的至少25、26、27、28或者29个氨基酸，或者由表示为SEQ ID NO：3的序列的至少25、26、27、28或者29个氨基酸组成。9.根据任何前述权利要求所述的方法，其中，所述肽或者其变体或片段包含至少15、20、25或者30个氨基酸残基，或者由至少15、20、25或者30个氨基酸残基组成，并且与SEQ ID NO：3具有至少90％或者95％的序列同一性。10.根据任何前述权利要求所述的方法，其中，向动物施用的所述肽或者其变体或片段的浓度小于1mM，或者小于750μM，或者小于500μM，或者小于400μM，或者小于300μM，或者小于200μM，或者小于100μM，或者小于75μM，或者小于60μM。11.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述肽或者其变体或片段的浓度小于50μM、或者小于40μM、或者小于30μM、或者小于20μM、或者小于10μM、或者小于5μM、或者小于3μ
M。12.根据任何前述权利要求所述的方法，其中施用的所述肽或者其变体或片段的浓度大于0.01μM，或者大于0.1μM，或者大于1μM，或者大于3μM，或者大于5μM，或者大于10μM，或者大于20μM。13.根据任何前述权利要求所述的方法，其中施用的所述肽或者其变体或片段的浓度大于30μM、或者大于40μM、或者大于50μM、或者大于60μM、或者大于70μM、或者大于80μM、或者大于90μM。14.根据任何前述权利要求所述的方法，其中施用的所述肽或者其变体或片段的浓度为0.01μM至1000μM，或者0.1μM至500μM，或者1μM至100μM，或者1μM至90μM之间。15.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述肽或者其变体或片段的浓度为0.1μM至80μM，或者0.1μM至70μM，或者0.1μM至60μM，或者0.1μM至50μM，或者0.1μM至40μM，或者0.1μM至30μM，或者0.1μM至20μM，或者0.1μM至10μM之间。16.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述肽或者其变体或片段的浓度为10μM至80μM，或者20μM至80μM，或者30μM至70μM，或者40μM至60μM之间。17.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述肽或者其变体或片段的浓度为0.1
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99μM。18.根据任何前述权利要求所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏珊，
申请(专利权)人：神经生物有限公司，
类型：发明
国别省市：