用于筛选文库的方法技术

本发明专利技术涉及鉴定内切核酸酶的DNA靶序列的方法。用于该方法的底物文库和工程化改造内切核酸酶以具有改善的对特定底物的切割效率的方法形成本发明专利技术的其他方面。方法形成本发明专利技术的其他方面。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于筛选文库的方法
专利

[0001]本专利技术涉及鉴定内切核酸酶的DNA靶序列的方法。用于该方法的底物文库和工程化改造内切核酸酶以具有改善的对特定底物的切割效率的方法形成本专利技术的其他方面。
[0002]专利技术背景
[0003]能够切割基因组内单个位点的内切核酸酶通过刺激非同源末端连接或同源重组而具有巨大的基因组编辑的潜力，并且多种工程化改造的内切核酸酶已经进入临床试验，包括CCR5
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2246(靶向人CCR5)和VR24684(靶向人VEGF
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A启动子)。尽管有能力工程化改造某些核酸酶(例如RNA引导的核酸酶，诸如Cas9/向导RNA、TALEN或锌指核酸酶)以对特定的独特靶序列具有特异性，但很明显这些核酸酶也可能与其他脱靶序列相互作用并在其他脱靶序列处切割。事实上，一些工程化改造的核酸酶与细胞毒性和致瘤性有关。在2016年11月15日的科学委员会会议上，FDA指出批准治疗性内切核酸酶时，需要考虑切割的特异性。
[0004]鉴于对脱靶切割的担忧，已经进行了各种尝试来表征与内切核酸酶经工程化改造本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.底物文库，其包含多个DNA底物，其中所述文库内的每个底物含有推定的靶序列，所述推定的靶序列是能够独特地鉴定所述推定的靶序列的标识符DNA序列的5
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，所述标识符DNA序列是与反向PCR引物相同的序列的5
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，并且其中所述文库内的所述双链DNA底物彼此之间的不同仅在于所述推定的靶序列和标识符DNA序列。2.根据权利要求1所述的底物文库，其中所述DNA底物是双链DNA底物。3.根据权利要求2所述的底物文库，其中所述文库内的每个底物另外含有与正向引物互补的序列，其中此序列位于所述推定的靶序列的5
’
。4.根据权利要求1所述的底物文库，其中所述DNA底物是单链底物。5.根据权利要求1至4中任一项所述的底物文库，其中每个推定的靶序列的序列与相关标识符序列的序列不相同。6.根据权利要求1至5中任一项所述的底物文库，其中所述底物文库中的所述推定的靶序列中的每一个与所述底物文库中的其他推定的靶序列长度相同，并且其中所述底物文库中的所述标识符DNA序列中的每一个与所述底物文库中的其他标识符DNA序列长度相同。7.根据权利要求1至6中任一项所述的底物文库，其中在所述文库中存在的所述推定的靶序列作为整体包括内切核酸酶的特征化靶序列和此特征化靶序列的所有可能的单个变体。8.根据权利要求7所述的底物文库，其中所述内切核酸酶是RNA引导的核酸酶、大范围核酸酶、TALEN或锌指核酸酶。9.根据前述权利要求中任一项所述的底物文库，其中每个DNA底物在其5
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末端具有亲和标签。10.用于制备如权利要求2至3和5至9中任一项所定义的底物文库的方法，其包括用文库正向引物和文库反向引物对多个推定的靶序列进行PCR扩增的步骤，所述推定的靶序列侧接有a)与所述文库正向引物互补的序列和b)与所述文库反向引物序列的部分相同的序列，其中所述文库反向引物是含有不同标识符序列的DNA序列的异质混合物，所述不同标识符序列位于与所述反向引物互补的所有序列共有的序列的5
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，并且其中所述不同标识符序列的数目以摩尔超过推定的靶序列的数目。11.用于鉴定内切核酸酶的DNA靶序列的方法，其包括以下步骤：a)在合适的条件下使权利要求1中所定义的底物文库与内...

【专利技术属性】
技术研发人员：B多尔，G斯卡韦洛，
申请(专利权)人：葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司，
类型：发明
国别省市：