一种产L-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种对棒杆菌中ptsS基因编码序列引入点突变或改进其表达的方法，所述方法可以使带有所述突变的菌株提高L

【技术实现步骤摘要】
一种产L
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氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及一种产L
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氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]L
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赖氨酸(L
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Lysine)对人和动物的生长发育具有重要作用，由于不能通过转氨作用合成，是人和动物的必须氨基酸之一，被称为第一限制性氨基酸，广泛用于食品加工，医药制剂，饲料添加剂等方面。目前世界市场对L
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赖氨酸总需求量约为160余万吨，年增长率大约7％
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8％，因此提高L
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赖氨酸产量显得十分重要。
[0003]目前L
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赖氨酸主要采用直接发酵法生产，直接发酵法利用具备完整L
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赖氨酸生物合成途径的菌株，以废糖蜜、淀粉水解液等为底物，通过好氧发酵生产。目前国内外L
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赖氨酸发酵菌株主要是谷氨酸棒杆菌突变菌株，影响其产量的主要因素在于生产菌，因此提高L
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赖氨酸生产菌株的生产能力是当前研究的重点。
[0004]L
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谷氨酸主要用于生产味精、香料，以及用作代盐剂、营养增补剂和生化试剂等。L
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谷氨酸本身可用作药物,参与脑内蛋白质和糖的代谢,促进氧化过程,该品在体内与氨结合成无毒的谷酰胺,使血氨下降,减轻肝昏迷症状。过去生产味精主要用小麦面筋(谷蛋白)水解法进行，现改用微生物发酵法来进行大规模生产。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是开发用于改善细菌的L
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氨基酸生产能力的新技术，从而提供一种有效生产L
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氨基酸的方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的专利技术人研究发现，本领域已知的在PTS转运系统中转运蔗糖的基因ptsS，可以通过修饰该基因或改善其表达，使之具有显著的L
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氨基酸生产能力。基于这些发现，完成了本专利技术。
[0007]本专利技术提供了生成L
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氨基酸的细菌，其中编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达改善。本专利技术还提供了通过使用所述微生物生产L
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氨基酸的方法。
[0008]本专利技术的第一个方面提供了生成L
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氨基酸的细菌，其具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本专利技术，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。
[0009]所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因ptsS编码的蛋白。
[0010]所述细菌具有增强的L
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氨基酸生产能力。
[0011]具有L
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氨基酸生产能力的细菌可以是能够在培养基中以优选0.5g/L以上，更优选1.0g/L以上的量积累目标L
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氨基酸的细菌。
[0012]所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨
基酸序列。
[0013]可以如下手段增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。
[0014]可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述氨基酸序列。
[0019]在本专利技术的一些具体实施方式中，使用的载体是pK18mobsacB质粒，pXMJ19质粒。
[0020]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述表达改善是指编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第162位蛋氨酸被不同的氨基酸所取代。
[0022]根据本专利技术，优选第162位蛋氨酸被苏氨酸所取代。
[0023]根据本专利技术，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第162位蛋氨酸被苏氨酸所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0024]在本专利技术的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列第485位碱基发生突变而形成的。
[0025]根据本专利技术，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第485位碱基由胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)。
[0026]在本专利技术的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
[0027]根据本专利技术，所述多核苷酸序列与调节序列可操作连接。
[0028]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述启动子是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸(ptsS基因)的启动子。
[0029]根据本专利技术，所述细菌可以是属于棒杆菌属的微生物，例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、北京
棒杆菌(Corynebacterium pekinense)。
[0030]在本专利技术的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌YP97158，保藏编号：CGMCC No.12856，保藏日期：2016年8月16本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生成L
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氨基酸的细菌，其特征在于，具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达；优选，所述改善的表达是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。2.如权利要求1所述的细菌，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第162位蛋氨酸被不同的氨基酸所取代。根据本发明，优选第162位蛋氨酸被苏氨酸所取代。3.如权利要求1
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2任一项所述的细菌，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的细菌，其特征在于，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列第485位碱基发生突变而形成的。根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列第485位碱基由胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)。优选，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。5.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓群，赵春光，孟刚，魏爱英，马风勇，杨立鹏，贾慧萍，苏厚波，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：