利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法技术

本发明专利技术公开了一利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法，属于植物基因工程技术领域，首先构建CRISPR/Cas9基因敲除载体质粒，热激发将载体质粒转到EHA105农杆菌中制备侵染液，将杂交构树叶子浸泡到侵染液里，真空抽滤5

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程和基因组编辑
，特别涉及 CRISPR/Case9系统对杂交构树基因定点突变的方法，F5H蛋白在调控杂交构树株型中的应用。

技术介绍

[0002]杂交构树(Broussonetia papyrifera L.)为桑科构树属落叶乔木，又名鹿仔树等，是构树杂交出的优良种，广泛分布于我国大部分温带以及热点地区。杂交构树的对于干旱、盐碱等特殊恶劣环境有着极强的适应性性，并且能够快速生长，是我国理想的用于城市绿化以及退耕还林治理土地荒漠化的树种。除此之外，杂交构树还是是我国分成重要的经济林木之一，其树皮所含有的纤维品质优良，可广泛用于造纸及创制新型纺纱材料；其树叶可以治疗小鼠肥硕，主要通过能促进小鼠体内的油脂减少，从而改变内脏脂肪变性达到治疗的目的，并且其叶还可以代替苜蓿(牧草之王)草粉和豆粕，作为添加在猪牛羊等家畜的青贮饲料；从其叶提取出的汁液有效地杀死昆虫，人们可以避开化学合成的污染环境的杀虫剂，从构树叶中提纯开发出天然植物生物杀虫剂。基于以上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)从文献中获取杂交构树F5H基因序列，设计引物；BPF5H
‑
F:ATGGATACCAAAAGTATCACCTCCBPF5H
‑
R:TCAGATGGTGCACACGACACGT(2)根据已经获得的构树BpF5H基因序列，以及CRISPR载体设计原则，选取的三个靶位点分别为
‘
ATCCCCCTCCTCTTCCTCCT
’
,
‘
ATCATCGGGAGCATGTCGAT
’
,
‘
TCAGGTACCTGACGTACGAC
’
；(3)选定靶位点后，使用高保真酶对片段进行PCR扩增，设计不同靶位点相应的引物，以包含tRNA和sgRNA序列的pGTR载体为模板；PCR扩增并进行胶回收获得200bp的片段，然后取出PCR反应产物进行胶回收；引物序列如下：BrF5H
‑
tRNA
‑
CRISPR
‑
35S
‑
B
‑
1:TAGGTCTCAGTCAAACAAAGCACCAGTG；BrF5H
‑
tRNA
‑
CRISPR
‑
sgRNA1
‑
2:GCGGTCTCAGAGGAGGGGGATTGCACCAGCCGGGAA；BrF5H
‑
tRNA
‑
CRISPR
‑
sgRNA1
‑
3:TAGGTCTCACCTCTTCCTCCTGTTTTAGAGC；BrF5H
‑
tRNA
‑
CRISPR
‑
sgRNA2
‑
4:GCGGTCTCAGAGCATGTCGATTGCACCAGCCGGGAA；BrF5H
‑
tRNA
‑
CRISPR
‑
sgRNA2
‑
5:TAGGTCTCAGCTCCCGATGATGTTTTAGAGCTAGAAA；BrF5H
‑
tRNA
‑
CRISPR
‑
sgRNA3
‑
6:GCGGTCTCACTGACGTACGACTGCACCAGCCGGGAA；BrF5H
‑
tRNA
‑
CRISPR
‑
sgRNA3
‑
7:TAGGTCTCATCAGGTACCTGAGTTTTAGAGCTAGAAA；BrF5H
‑
tRNA
‑
CRISPR
‑
35S
‑
B
‑
8:TAGGTCTCAAAACAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC；(4)回收的目的片段通过一步法连接T4连接酶，连接反应产物转入DH5α，鉴定阳性克隆并测序，将测序结果和已经报道的序列对比，将测序正确的菌落培养后提取CRISPR/Cas9
‑
BpF5H载体质粒并在
‑
20℃保存；(5)采集杂交构树的叶子，叶子大小为4.5
‑
5.5cm，使用7％的次氯酸钠消毒10min，用无菌水清洗至无菌、无消毒剂残留，吸干水分；(6)提前制备侵染液：热激发将步骤(4)制备的载体质粒转到EHA105农杆菌中，筛选出阳性菌落，置于
‑
80℃冰箱备用；取出菌液与相应抗生素LB中摇菌，当OD
600
＝0.4
‑
0.5时加100μmol
·
L
–1乙酰丁香酮，2h后离心富集菌液，使用N6侵染液重悬为OD
600
＝0.2
‑
0.3，侵染液制备完成；所述N6侵染液是N6基础培养基中含有终浓度为30g
·
L
‑1蔗糖，100μmol
·
L
–1乙酰丁香酮，pH值为6；(7)将步骤(5)处理的叶子剪成1cm小块浸泡到制备好的侵染液中，同时真空抽滤5
‑
8min；将侵染液吸干，置于共培养基N6AS共培养两天；所述共培养基N6AS是N6基础培养基中含有终浓度为30g
·
L
‑1蔗糖，7.8g
·
L...

【专利技术属性】
技术研发人员：付春祥，徐悦，曹英萍，吴振映，何峰，李瑞，苏昆龙，姜珊珊，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
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