一种新型TTF-1启动子调控基因及其表达应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新型TTF

【技术实现步骤摘要】
一种新型TTF
‑
1启动子调控基因及其表达应用


[0001]本专利技术涉及生物基因技术，具体为一种新型TTF
‑
1启动子调控基因及其表达应用。

技术介绍

[0002]癌症是恶性肿瘤引起的，恶性肿瘤具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，癌症是目前医学上最为棘手和死亡率极高的疾病之一。
[0003]癌症主要治疗技术包含手术治疗、化学治疗、放射线治疗和基因治疗等。
[0004]肿瘤基因治疗是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗，是指将具有正常功能的基因或有治疗作用的基因通过一定的方式导入靶细胞，直接针对肿瘤的根源而发挥治疗作用。
[0005]随着相关分子生物学技术的不断发展和完善，肿瘤基因治疗技术也得到了迅速的发展，但是在从基础研究过渡到临床试验阶段时，肿瘤基因治疗的靶向性问题仍然没有得到较好的解决。靶向性是指在基因治疗的过程中将治疗基因的作用高效地限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响其他正常的细胞、组织或器官的功能，这对于肿瘤的基因治疗是非常重要的，肿瘤基因治疗的靶向性问题直接关系到治疗的成败。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服上述
技术介绍
困难，对调控外源治疗基因表达的组织特异性TTF
‑
1启动子核心序列进行改造，使改造后的新型TTF
‑
1启动子能更有效的靶向调控外源治疗基因的表达，提供一种新型TTF
‑
1启动子调控基因及其表达应用。/>[0007]为达到上述目的，采用的技术方案为：一种新型TTF
‑
1启动子调控基因，利用定点突变技术对长度为359bp的TTF
‑
1核心序列进行改造得到，具体如下：36986493bp
‑
36986497bp序列由原TGGCT突变为TGGCA，36986636bp
‑
36986640bp序列由原TGGCC突变为TGGCA，命名为p
‑
opt1
Tcor
‑
miR
‑
7。
[0008]或者：36986493bp
‑
36986497bp序列由原TGGCT突变为TGGCA，36986563bp
‑
36986567bp序列由原ATGCA突变为TGGCA，36986610bp
‑
36986614bp序列由原GGGCA突变为TGGCA，36986636bp
‑
36986640bp序列由原TGGCC突变为TGGCA，命名为p
‑
opt2
Tcor
‑
miR
‑
7。
[0009]上述的新型TTF
‑
1启动子调控基因的表达方法，其特征在于，包含以下步骤：1）、扩增miR
‑
7基因通过GeneBank获得miR
‑
7前段5
’
端
‑
1064位点到其3
’
端侧翼+124位点的序列设计引物；以人肺癌95D细胞基因组DNA为模板，PCR扩增miR
‑
7序列；2）、p
‑
EGFP
‑
N1
‑
miR
‑
7载体构建将miR
‑
7的PCR产物克隆入p
‑
EGFP
‑
N1载体中，连接产物经转化、挑克隆、摇菌后提
序列。
[0022]将miR
‑
7的PCR产物克隆入p
‑
EGFP
‑
N1载体中，连接产物经转化、挑克隆、摇菌后提取质粒，使用限制性内切酶KpnI和BamHI酶做双酶切鉴定，酶切鉴定后测序，通过测序鉴定后得到正确的重组质粒p
‑
EGFP
‑
N1
‑
miR
‑
7。
[0023]根据TTF
‑
1启动子长度为1612bp、1212bp和853bp的核心序列设计引物。1612bp：上游引物: 5
’‑ꢀ
CGGCATCTTGTAAACTGACTGCATCCCTA
ꢀ‑ꢀ3’
; 下游引物: 5
’ꢀ‑ꢀ
GCCATTAGCCTGGGGGACTAGATC
ꢀ‑ꢀ3’
。1212bp：上游引物: 5
’‑ꢀ
CCGGACTCAAACCCTAGGCAATCC
ꢀ‑ꢀ3’
; 下游引物: 5
’ꢀ‑ꢀ
GGCGAAGCCTCCGTACCCGGATTACCC
ꢀ‑ꢀ3’
。853bp：上游引物: 5
’‑ꢀ
CGCAGACCCAGCTAGCACCCTACCCGAGC
ꢀ‑ꢀ3’
;下游引物: 5
’ꢀ‑ꢀ
GCCCAGTCCCCTGACCCTGAGGGCCTA
ꢀ‑ꢀ3’
。以人肺癌95D细胞基因组DNA为模板，PCR扩增TTF
‑
1启动子核心序列。
[0024]将TTF
‑
1核心序列启动子的PCR产物克隆入p
‑
EGFP
‑
N1
‑
miR
‑
7载体中，连接产物经转化、挑克隆、摇菌后提取质粒，使用限制性内切酶AseI和酶KpnI做双酶切鉴定，酶切鉴定后测序，通过测序鉴定后得到正确的重组质粒p
‑
Tcor1
‑
miR
‑
7、p
‑
Tcor2
‑
miR
‑
7和p
‑
Tcor3
‑
miR
‑
7。
[0025]常规培养人肺癌95D细胞，按5
×
104个细胞铺于24孔板中，将10 ug三组不同TTF
‑
1启动子核心序列长度的质粒p
‑
Tcor
‑
miR
‑
7和对照质粒p
‑
Cont体外分别利用Lipofectamine 2000瞬时转染细胞后，继续在5% CO2，37℃条件下培养。48小时后，抽取各组细胞总RNA，利用Real
‑
time PCR探针法检测miR
‑
7表达水平。结果显示，TTF
‑
1启动子序列为1212bp的p
‑
Tcor2
‑
miR
‑
7真核表达载体转染组中miR
‑
7的表达水平显著升高，p
‑
Tcor2
‑
miR
‑
7载体转染组中95D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型TTF
‑
1启动子调控基因，利用定点突变技术对长度为359bp的TTF
‑
1核心序列进行改造得到，其特征在于：36986493bp
‑
36986497bp序列由原TGGCT突变为TGGCA，36986636bp
‑
36986640bp序列由原TGGCC突变为TGGCA，命名为p
‑
opt1
Tcor
‑
miR
‑
7。2.一种新型TTF
‑
1启动子调控基因，利用定点突变技术对长度为359bp的TTF
‑
1核心序列进行改造得到，其特征在于：36986493bp
‑
36986497bp序列由原TGGCT突变为TGGCA，36986563bp
‑
36986567bp序列由原ATGCA突变为TGGCA，36986610bp
‑
36986614bp序列由原GGGCA突变为TGGCA，36986636bp
‑
36986640bp序列由原TGGCC突变为TGGCA，命名为p
‑
opt2
Tcor
‑
miR
‑
7。3.根据权利要求1或2所述的新型TTF
‑
1启动子调控基因的表达方法，其特征在于，包含以下步骤：1）、扩增miR
‑
7基因通过GeneBank获得miR
‑
7前段5
’
端
‑
1064位点到其3
’
端侧翼+124位点的序列设计引物；以人肺癌95D细胞基因组DNA为模板，PCR扩增miR
‑
7序列；2）、p
‑
EGFP
‑
N1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐林，官蔹，周涯，郭萌萌，赵娟娟，陈超，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：