红花CtFT1基因在提高植物黄酮含量方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了红花CtFT1基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；红花CtFT1基因，是将红花盛花期花瓣中的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用引物进行PCR扩增获得；一种表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因；植物表达载体为pCAMBIA3301；红花CtFT1基因在提高植物黄酮含量方面的应用；结果表明，超表达CtFT1基因的拟南芥均表现为提早开花，且黄酮含量高于野生型拟南芥株系；本发明专利技术红花CtFT1基因，具有转录调控基因表达特性，通过转录调节黄酮代谢相关基因的表达，能够提高红花中总黄酮，为培育高黄酮含量新品系奠定了坚实的基础。酮含量新品系奠定了坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】
红花CtFT1基因在提高植物黄酮含量方面的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及红花CtFT1基因在提高植物黄酮含量方面的应用。

技术介绍

[0002]红花（Carthamus tinctorius L.）为一年生草本植物，属菊科植物的干燥管状花。红花具有活血通经，去瘀疗伤，宣毒透疹等功效，其主要有效成分为红花黄色素和红花红色素。红花黄色素为红花中多种水溶性查尔酮成分的混合物，不但是很有价值的食用色素，而且具有活血通络、消炎镇痛等功效，在血管性疾病、高血压、糖尿病并发症等发面亦有重要作用。成花素基因Flowering Locus T (FT）是植物成花途径中的关键整合子之一，在植物成花过程中起促进作用。FT蛋白主要在叶片中表达，通过筛管运输到植物茎尖分生组织（SAM），在那里通过14
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3蛋白的介导与b ZIP转录因子FD结合形成成花激活复合体（florigen activation complex，FAC），FAC激活下游成花基因使植物成花。实验室前期研究显示，红花FT基因在红花花瓣中花蕾期至盛花期的相对表达量升高，盛花期至衰败期降低，与类黄酮含量变化趋势一致，暗示红花成花过程与类黄酮代谢合成可能存在联系。目前，国内外关于成花素蛋白FT及其同源蛋白的研究报道较多，主要集中在水稻、棉花、大豆、小麦、龙眼等多种作物中。但在红花中关于成花素基因Flowering Locus T的克隆及表达分析，特别是与类黄酮代谢合成的关系还未见报道。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的是提供红花CtFT1基因在提高植物黄酮含量方面的应用。
[0004]红花CtFT1基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
[0005]红花CtFT1基因，是将红花盛花期花瓣中的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用引物：CtFT1F: ATGGCGCGTAGAGAGAGAGACtFT1R:TTATCTCCGTCGTCCGCCG进行PCR扩增获得。
[0006]一种表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因；所述的植物表达载体为pCAMBIA3301。
[0007]红花CtFT1基因在提高植物黄酮含量方面的应用；所述的植物为红花或拟南芥。
[0008]本专利技术提供了红花CtFT1基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；红花CtFT1基因，是将红花盛花期花瓣中的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用引物：CtFT1F: ATGGCGCGTAGAGAGAGAGA、CtFT1R:TTATCTCCGTCGTCCGCCG进行PCR扩增获得；一种表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因；所述的植物表达载体为pCAMBIA3301；红花CtFT1基因在提高植物黄酮含量方面的应用；所述的植物为红花或拟南
芥；结果表明，超表达CtFT1基因的拟南芥均表现为提早开花，且黄酮含量高于野生型拟南芥株系；本专利技术红花CtFT1基因，具有转录调控基因表达特性，通过转录调节黄酮代谢相关基因的表达，能够提高红花中总黄酮的含量，为培育高黄酮含量新品系奠定了坚实的基础。
附图说明
[0009]图1 红花花瓣RNA提取；图2 CtFT1基因连接克隆载体的菌液PCR图；图3 CtFT1基因连接克隆载体的酶切鉴定图；图4 茉莉酸甲酯胁迫下CtFT1基因的表达与黄酮含量相关性；图5 干旱胁迫下CtFT1基因的表达与黄酮含量相关性；图6 pCAMBIA3301
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CtFT1的菌液PCR鉴定。
具体实施方式
[0010]实施例1 红花RNA提取及反转录实验材料：吉红一号红花盛花期花瓣；实验步骤如下：1、红花花瓣RNA提取1) 镊子、研钵、研棒和药匙用锡箔纸包好，放在180℃烘箱里干热灭菌4h，备用；2) 1.5mL离心管、移液器吸头用0.1％DEPC水处理过夜，然后120℃高压灭菌20min，放置到60℃烘箱中干燥，备用；3) 取红花花瓣约100mg，加入液氮迅速研磨至细粉，分装到两个1.5mLEP管中，各加入1mL RNAiso Plus后混合均匀，室温静置5min；4) 4℃，12000rpm离心5min，取上清液转移到新的1.5mL离心管中；5) 加入1/5 RNAiso Plus体积量的氯仿，振荡，混匀，室温静置5min；6) 4℃，12000rpm离心15min，取上清液转移到新的1.5mL离心管中；7) 加入与上清液等体积的异丙醇，室温静置10min，4℃，12000rpm离心10min；8) 弃上清取沉淀，向沉淀中加入1mL 75%乙醇清洗沉淀，4℃，12000rpm离心5min，此步骤重复一次；9) 弃上清保留沉淀，室温晾干；10) RNA
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Free水回溶RNA，提取的RNA保存于
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80℃备用。
[0011]11) 红花总RNA样品浓度用NanoDrop2000超微量分光光度计(购自Thermo公司)测定。
[0012]12) 用2% 的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 纯度，电泳结束后用核酸染料染色，在紫外凝胶成像系统上拍照，红花花瓣总RNA提取见图1，由图1可以看到28S和18S清晰的两条带，且28S条带的亮度约为18S的2倍。说明RNA提取完整，无降解，可以满足后续试验需要。
[0013]2、第一条链cDNA的合成取
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80℃保存的RNA，通过NANODROP微量核酸蛋白测定仪检测RNA的浓度，提取的RNA浓度均在1000ng/ul左右。按照反转录试剂盒的操作说明进行cDNA的反转录，反转录反应体系见表1和表2，反转录后的cDNA保存于
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20℃冰箱中备用。
[0014]在PCR仪上进行一下反应：65℃，5min ，迅速至于冰上急冷。
[0015]反转录反应条件42℃
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55min70℃
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10min置于冰上冷却，得到cDNA用于后续反应，在
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20℃冻存以留备用。
[0016]实施例2 红花FT1基因编码区序列的克隆前期对红花进行全基因组测序，注释到红花开花基因Flowering Locus T1基因，通过不同开花时期的转录组测序分析发现，其表达趋势与黄酮含量趋势一致，推测红花FT1可能与黄酮合成相关；因此本项目以红花的花瓣cDNA为模板，根据基因组中注释得到的编码区序列设计特异性引物进行RT
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PCR扩增，克隆引物：CtFT1F: ATGGCGCGTAGAGAGAGAGACtFT1R:TTATCTCCGTCGTCCGCCG以吉红一号红花盛花期花瓣RNA反转录所得cDNA为模板进行扩增，将扩增产物与pEASY
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T1（北京全式金生物技术有限公司）克隆载体连接，并转化DH5α大肠杆菌感受态，通过菌液PCR（图2）与Hind III、Xho I酶切验证（本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.红花CtFT1基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。2.红花CtFT1基因，是将红花盛花期花瓣中的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用引物：CtFT1F: ATGGCGCGTAGAGAGAGAGACtFT1R:TTATCTCCGTCGTCCGCCG进行PCR扩增获得。3.一种表达载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀明，李志凌，姚娜，王南，马鑫彤，洪瑛琪，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：