一种埃可病毒9型抗体检测方法技术

本发明专利技术公开了一种埃可病毒9型抗体检测方法，本发明专利技术将ECHO9 VP1重组蛋白作为酶标板的抗原，突破以往直接用病毒株灭活作为抗原包被酶标板，或者用病毒株感染细胞制备抗原片的局限，实现了酶标抗原板制备高通量和安全性的要求。本发明专利技术不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗，而且对ECHO9引起突发疫情早发现、早干预、流行病学的研究，保障人民群众健康起到技术支持的重要作用。持的重要作用。持的重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一种埃可病毒9型抗体检测方法


[0001]本专利技术涉及医疗
，具体为一种埃可病毒9型抗体检测方法。

技术介绍

[0002]埃可病毒9型(Echovirus 9，ECHO9)引起的无菌性脑炎暴发在美国、加拿大、英国、欧洲、日本、韩国等地均有报道。在国内病毒性脑炎发病率较高，但报道ECHO9引起的病毒性脑炎较少，这可能与没有有效检测ECHO9的方法有关。目前对ECHO9的病原学检测主要采用病毒培养，血清中和试验或者RT
‑
PCR扩增目的基因条带，然后进行基因测序，在GeneBank网站进行Blast比对来确定埃可病毒的型别。这些方法共同的不足是费时、费力、不能高通量检测，而且对实验人员及仪器设备的要求比较高、成本较大，不能在基层实验室进行。因此ECHO9抗体检测方法建立不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗，而且对突发疫情早发现、早干预，保障人民群众健康起到至关重要的作用。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于，提供一种埃可病毒9型抗体检测方法。本专利技术不仅具有检测快捷、准确性高的优点，而且满足检测高通量和安全性的要求。
[0004]本专利技术的技术方案：一种埃可病毒9型抗体检测方法，按以下步骤进行：
[0005]S1：ECHO9 pET28a
‑
VP1重组质粒制备：在ECHO9 VP1序列进行大肠杆菌的稀有密码子优化，重新基因合成ECHO9 VP1序列；
[0006]质粒pET28a+表达阅读框设计VP1基因的扩增引物：
[0007]上游引物：5'
‑
CATATGGGTAGGGTTGCTGACACAATACG
‑
3'，含NdeI酶切位点和启始密码子ATG；
[0008]下游引物：5'
‑
CTCGAGTTACACATACACAGCTCCAGATTCTTGG
‑
3'，含XhoI酶切位点；
[0009]重新合成的ECHO9 VP1序列和质粒pET28a+原核表达载体用NdeI和XhoI分别进行双酶切，获得ECHO9 pET28a
‑
VP1重组质粒；
[0010]S2：高效表达ECHO9 VP1重组蛋白及验证：采用IPTG诱导的重组菌高效表达ECHO9 VP1重组蛋白，并利用该蛋白的N末端含有的6个组氨酸，用镍柱亲和层析法使其得到纯化和鉴定，获得37kD ECHO9 VP1重组蛋白；
[0011]S3：酶标抗原板制备:用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制10μg/ml的重组蛋白溶液，96孔酶标板每孔加0.1ml，4℃包被过夜；次日用0.05％Tween 20
‑
0.01mol/L PBS洗涤3次后用20％小牛血清封闭，制备好的酶标抗原板密封于4℃冰箱保存；
[0012]S4:人血清中ECHO9 IgM/IgG抗体检测方法建立：以1:20稀释的人血清为一抗；1:5000稀释的HRP标记羊抗人IgM或HRP标记羊抗人IgG为二抗、TMB为显色底物，建立检测ECHO9 VP1
‑
IgM/IgG
‑
ELISAs，在终止反应后用Bio
‑
Rad酶标仪测定各孔OD值：测定波长为450nm，参比波长为630nm；若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
[0013]上述的埃可病毒9型抗体检测方法，步骤S1中，采用T4连接酶连接，连接后将产物
转入E.coli DH 5α中培养，挑取单克隆进行PCR，酶切及测序鉴定重组质粒。
[0014]前述的埃可病毒9型抗体检测方法，步骤S4中，人血清中ECHO9 IgM或IgG抗体检测操作步骤如下：
[0015]S4.1、试验设阴性对照2孔和阳性对照1孔，每孔加相应液体100μL；设空白对照1孔空置；
[0016]S4.2、样品孔加入用生理盐水或PBS1：20稀释的血清样品100μL，振荡混匀后贴上封口膜，置于37℃孵箱30分钟；
[0017]S4.3、配制0.05％Tween 20
‑
0.01mol/L PBS洗涤液备用；
[0018]S4.4、置洗板机洗板，重复洗板5次；
[0019]S4.5、加入酶标工作液，每孔100μL，空白孔不加，置于37℃孵箱30分钟；
[0020]S4.6、置洗板机洗板，重复洗板5次；
[0021]S4.7、吸100μL TMB到每孔，充分混匀，置室温显色10分钟；
[0022]S4.8、立即加入终止液每孔100μL，置酶标仪测定波长为450nm，参比波长为630nm。以空白孔调零，读取各孔OD值；若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
[0023]前述的埃可病毒9型抗体检测方法，所述人血清中ECHO9 IgM或IgG抗体检测操作的结果判断包括：
[0024]人血清中IgM、IgG抗体均为阴性，则未感染ECHO9；
[0025]人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阴性，则为ECHO9感染急性期；
[0026]人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阳性，则为ECHO9感染恢复期；
[0027]人血清中ECHO9 IgM阴性、IgG阳性，则为ECHO9既往感染。
[0028]与现有技术相比，本专利技术将ECHO9 VP1重组蛋白作为酶标板的抗原，突破以往直接用病毒株灭活作为抗原包被酶标板，或者用病毒株感染细胞制备抗原片的局限，实现了酶标抗原板制备高通量和安全性的要求。本专利技术将表达、纯化好的ECHO9 VP1重组蛋白包被酶标板，优化ELISA的试验条件，建立间接ELISA方法检测人血清中抗ECHO9的IgM和IgG方法。本专利技术不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗，而且对突发疫情早发现、早干预，保障人民群众健康起到至关重要的作用。
附图说明
[0029]图1为本专利技术的流程步骤图；
[0030]图2为ECHO9 pET28a
‑
VP1重组质粒构建示意图；
[0031]图3为重组质粒pET28a
‑
VP1的酶切鉴定示意图；
[0032]图4是Western blot鉴定纯化后VP1蛋白示意图；
[0033]图5是Western blot鉴定VP1蛋白兔抗体示意图；
[0034]图6是ELISA法鉴定VP1蛋白兔抗体滴度示意图。
具体实施方式
[0035]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不作为对本专利技术限制的依据。
[0036]实施例：一种埃可病毒9型抗体检测方法，如图1所示，按以下步骤进行：
[0037]S1：如图2所示，ECHO9 pET28a
‑
VP1重组质粒制备：在GenBank发表的ECHO9 VP1序列进行大肠杆菌的稀有密码子优化，重新基因合成ECHO9 VP1序列；
[0038]质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种埃可病毒9型抗体检测方法，其特征在于：按以下步骤进行：S1：ECHO9 pET28a
‑
VP1重组质粒制备：在ECHO9 VP1序列进行大肠杆菌的稀有密码子优化，重新基因合成ECHO9 VP1序列；质粒pET28a+表达阅读框设计VP1基因的扩增引物：上游引物：5'
‑
CATATGGGTAGGGTTGCTGACACAATACG
‑
3'，含NdeI酶切位点和启始密码子ATG；下游引物：5'
‑
CTCGAGTTACACATACACAGCTCCAGATTCTTGG
‑
3'，含XhoI酶切位点；重新合成的ECHO9 VP1序列和质粒pET28a+原核表达载体用NdeI和XhoI分别进行双酶切，获得ECHO9 pET28a
‑
VP1重组质粒；S2：高效表达ECHO9 VP1重组蛋白及验证：采用IPTG诱导的重组菌高效表达ECHO9 VP1重组蛋白，并利用该蛋白的N末端含有的6个组氨酸，用镍柱亲和层析法使其得到纯化和鉴定，获得37kD ECHO9VP1重组蛋白；S3：酶标抗原板制备:用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制10μg/ml的重组蛋白溶液，96孔酶标板每孔加0.1ml，4℃包被过夜；次日用0.05％Tween 20
‑
0.01mol/L PBS洗涤3次后用20％小牛血清封闭，制备好的酶标抗原板密封于4℃冰箱保存；S4:人血清中ECHO9 IgM/IgG抗体检测方法建立：以1:20稀释的人血清为一抗；1:5000稀释的HRP标记羊抗人IgM或HRP标记羊抗人IgG为二抗、TMB为显色底物，建立检测ECHO9 VP1
‑
IgM/IgG
‑
ELISAs，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱晓枫，潘劲草，汪皓秋，
申请(专利权)人：杭州市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：