一种外泌体PD-L1糖基化检测方法技术

本发明专利技术公开了一种外泌体PD

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体PD
‑
L1糖基化检测方法


[0001]本专利技术涉及一种外泌体PD
‑
L1糖基化检测方法。

技术介绍

[0002]外泌体上糖蛋白在跨膜信号传递、免疫抑制、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要的调节作用，外泌体特定蛋白的糖基化检测有助于理解其在生理病理过程中的作用。
[0003]目前外泌体蛋白糖基化的检测方法主要包括质谱(MS)、液相色谱(LC)和凝集素微阵列(LMA)等。但这些方法存在检测效率低，样品前处理过程复杂，无法研究完整外泌体等不足，因此难以实现生理状态下的外泌体蛋白糖基化水平灵敏分析。最近发展的代谢聚糖标记(MGL)策略通过在细胞培养基中加入非天然单糖和后续的化学偶联将功能性化学基团移植到细胞膜聚糖中，该方法保持细胞的完整性，不明显影响其生物学功能。然而MGL策略没有选择性，为了实现特定蛋白糖基化的选择性标记，需结合特定蛋白的识别手段，例如通过绿色荧光蛋白(GFP)或者靶标特异性适配体标记目标蛋白，结合MGL标记的特定功能化学基团，然后通过荧光共振能量转移(FRET)实现特定蛋白糖基化成像。然而FRET技术的检测灵敏度较低，不适用于低丰度的外泌体糖蛋白检测，及示踪糖基化的细微变化。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的，在于提供一种外泌体PD
‑
L1糖基化检测方法。
[0005]本专利技术的技术方案如下：
[0006]一种外泌体PD
‑
L1糖基化检测方法，包括如下步骤：
[0007]1)用PD
‑
L1适体即序列PDL1
‑
S
‑
T1，标记外泌体PD
‑
L1；
[0008]2)通过修饰环炔基DBCO的DNA即序列DBCO
‑
S
‑
T2，与代谢标记的外泌体表面糖上叠氮的无铜环加成反应标记外泌体的糖；
[0009]3)加入DNA连接臂，所述的连接臂分别具有和序列PDL1
‑
S
‑
T1的至少一段互补的序列以及和序列DBCO
‑
S
‑
T2的至少一段互补的序列；
[0010]4)加入探针H1和H2，其中，所述的探针H1和探针H2互补，且其中一探针分别具有和序列PDL1
‑
S
‑
T1的至少一段互补的序列以及和序列DBCO
‑
S
‑
T2的至少一段互补的序列；
[0011]5)扩增，检测扩增信号，得到外泌体PD
‑
L1糖基化信息。
[0012]优选地，序列PDL1
‑
S
‑
T1上与探针H1或H2互补的序列，和序列PDL1
‑
S
‑
T1上与连接臂互补的序列不重叠；序列DBCO
‑
S
‑
T2上与探针H1或H2互补的序列，和序列DBCO
‑
S
‑
T2上与连接臂互补的序列不重叠。
[0013]优选地，步骤3)中，所述的连接臂长度优选为20个
‑
80个碱基。
[0014]优选地，序列PDL1
‑
S
‑
T1上和连接臂互补的片段优选位于中间10
‑
20个碱基。
[0015]优选地，序列DBCO
‑
S
‑
T2上和连接臂互补的片段优选位于中间10
‑
20个碱基。
[0016]优选地，序列PDL1
‑
S
‑
T1上与探针H1或H2互补的序列位于序列PDL1
‑
S
‑
T1的末端10
‑
20个碱基，序列DBCO
‑
S
‑
T2上与探针H1或H2互补的序列位于序列DBCO
‑
S
‑
T2的末端5
‑
15
个碱基。
[0017]优选地，探针H1分别具有和序列PDL1
‑
S
‑
T1的至少一段序列互补的第一序列、和序列DBCO
‑
S
‑
T2的至少一段序列互补的第二序列以及和H2的一段序列互补的第三序列；探针H2具有和探针H1第三序列互补的序列，以及和第一序列、第二序列互补的序列，
[0018]优选地，步骤5)所述的扩增为HCR扩增。
[0019]优选地，步骤5)的检测采用荧光检测。
[0020]优选地，所述的荧光检测为H1上带有Alexa Fluor 488或者FAM探针，序列T1或T2上无修饰基团。
[0021]本技术方案与
技术介绍
相比，具有如下优点：
[0022]现有的糖基化检测方法包括质谱、色谱和凝集素阵列法需从外泌体中纯化糖蛋白，破坏了外泌体的完整性，很难实现生理状态下外泌体PD
‑
L1糖基化的研究。而本专利技术方法采用糖代谢标记和特异性适配体识别的方法分别标记糖以及蛋白，通过HCR放大外泌体特定蛋白糖基化信号，该方法无需先分离释放糖蛋白，操作简单，保持了外泌体的生物学活性。同时HCR扩增提高了外泌体特定蛋白糖基化的检测灵敏度，并可表征外泌体特定蛋白糖基化水平的变化及其随后的生物学功能的变化，能够用于外泌体糖蛋白组学研究。
附图说明
[0023]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。
[0024]图1为本专利技术的实验原理图。
[0025]图2为HCR在缓冲液体系中的组装，其中，A为琼脂糖凝胶图，B为荧光光谱图，C为荧光定量分析结果。
[0026]图3为PDL1
‑
S
‑
T1、DBCO
‑
S
‑
T2的识别性能表征。
[0027]图4为外泌体HCR扩增产物表征。
[0028]图5为流式细胞仪检测外泌体PD
‑
L1糖基化。
[0029]图6为激光共聚焦原位成像外泌体PD
‑
L1糖基化。
[0030]图7为外泌体PD
‑
L1糖基化水平对与PD
‑
1阳性细胞识别的影响
[0031]图8：(A)外泌体与PD
‑
1阳性细胞的结合示意图；(B)流式验证外泌体HCR对PD
‑
L1和PD
‑
1相互作用的影响
[0032]图9：(A)CLSM成像HCR扩增/未HCR扩增的A375外泌体与Jurkat细胞(PD
‑
1转染)的结合；(B)定量外泌体与PD
‑
1阳性Jurket细胞的结合(n＝20)
具体实施方式
[0033]如图1所示，本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体PD
‑
L1糖基化检测方法，包括如下步骤：1)用PD
‑
L1适体即序列PDL1
‑
S
‑
T1，标记外泌体PD
‑
L1；2)通过修饰环炔基DBCO的DNA即序列DBCO
‑
S
‑
T2，与代谢标记的外泌体表面糖上叠氮的无铜环加成反应标记外泌体的糖；3)加入DNA连接臂，所述的连接臂分别具有和序列PDL1
‑
S
‑
T1的至少一段序列互补的序列以及和序列DBCO
‑
S
‑
T2的至少一段序列互补的序列；4)加入探针H1和H2，其中，所述的探针H1和探针H2部分互补，且其中一探针分别具有和序列PDL1
‑
S
‑
T1的至少一段序列互补的序列以及和序列DBCO
‑
S
‑
T2的至少一段序列互补的序列；5)扩增，检测扩增信号，得到外泌体PD
‑
L1糖基化信息。2.根据权利要求1所述的一种外泌体PD
‑
L1糖基化检测方法，其特征在于：序列PDL1
‑
S
‑
T1上与探针H1或H2互补的序列，和序列PDL1
‑
S
‑
T1上与连接臂互补的序列不重叠；序列DBCO
‑
S
‑
T2上与探针H1或H2互补的序列，和序列DBCO
‑
S
‑
T2上与连接臂互补的序列不重叠。3.根据权利要求1所述的一种外泌体PD
‑
L1糖基化检测方法，其特征在于：步骤3)中，所述的连接臂长度为20个
‑
80个碱基。4.根据权利要求1所述的一种外泌体PD
‑
L1糖基化检测方法，其特征在于：序列PDL1
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，宋彦龄，康思因，尤振龙，王文成，张弛，朱琳，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：