一种空腔工程化技术提高酶热稳定性和催化活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种空腔工程化技术提高酶热稳定性和催化活性的方法，属于生物信息学、计算化学、生物工程、生物物理及蛋白质工程等领域。本发明专利技术首先以分子动力学模拟(MD)蛋白运动，通过聚类分析挑选出代表性构象后通过AQUA

【技术实现步骤摘要】
一种空腔工程化技术提高酶热稳定性和催化活性的方法


[0001]本专利技术属于生物信息学、计算化学、生物工程、生物物理及蛋白质工程等领域，具体涉及一种空腔介导的工程化技术提高酶热稳定性和催化活性的方法。

技术介绍

[0002]酶(Enzyme)通常是指由活细胞产生的具有高度特异性和催化作用的蛋白质或RNA，易受温度、pH等众多外界环境因素的影响。根据催化的反应类型的不同，可分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶等六大类。因酶具有良好的催化功能，在食品、医药、油脂生产和加工以及化妆品等工业领域均得到了广泛应用。
[0003]然而，实际工业生产中，由于较严苛复杂的工业条件，酶经常在温度、压力和溶液等各种外部干扰下发生结构转变，从而影响其稳定性和催化活性。因此，增强酶的稳定性和活性是工业生产中的一条必经之路。但是，在酶进化的过程中，经常伴随着热稳定性和催化活性间的折中，最后导致两者的提高只能取其一。例如，Shi等对NTU 03脂肪酶盖子区域的第189号天冬氨酸残基进行突变后导致该酶活性升高，但是热稳定性下降(Shih T W,P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时进化酶热稳定性和催化活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对待进化的酶蛋白结构进行分子动力学模拟，(2)分析酶蛋白结构的内部空腔，筛选出内部关键空腔，(3)选取每个内部关键空腔附近出现频率高于30％的氨基酸残基，同时排除活性位点同时排除活性位点范围内的残基位点尽可能避免突变对催化活性的影响，再利用Rosetta和FoldX5.0进行虚拟饱和突变、构建突变体文库、筛选出ΔΔG<0的即为潜在突变体；(4)利用定点突变技术，将潜在突变位点突变为目标氨基酸，对突变后的序列进行测序验证，然后利用基因工程菌进行表达，并经分离纯化后检测酶学性质，筛选出热稳定性和催化活性提高的突变体。2.根据权利要求1所述的一种同时进化酶热稳定性和催化活性的方法，其特征在于，步骤(1)对酶蛋白进行分子动力学模拟，每个蛋白以随机初始速度进行5个平行，每个平行时长30ns。3.根据权利要求1所述的一种同时进化酶热稳定性和催化活性的方法，其特征在于，步骤(2)筛选酶蛋白内部关键空腔，是指，以均方根偏差矩阵为根本将所有平行下的分子动力学模拟轨迹进行聚类分析并挑选出代表性构象，然后，利用McVol程序计算所有代表性构象的内部空腔，统计并筛选出现频率高于80％的空腔，作为内部关键空腔。4.根据权利要求1所述的一种同时进化酶热稳定性和催化活性的方法，其特征在于，步骤(3)首先根据温度因子B
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factor排序，统计步骤(2)挑选出的代表性构象中B
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factor排名前80的氨基酸残基，再结合步骤(2)筛选出的内部关键空腔，统计不同平行下每个内部关键空腔附近出现频率高于30％的氨基酸残基，同时排除活性位点范围内的残基位点以避免突变对催化活性的影响，再利用Rosetta和FoldX5.0进行虚拟饱和突变、构建突变体文库、筛选出ΔΔG<0的即为潜在突变体。5.根据权利要求2所述的一种同时进化酶热稳定性和催化活性的方法，其特征在于，步骤(1)所进行的分子动力学模拟，具体步骤如下：采用Gromacs进行分子动力学模拟，模拟时选择AMBER99力场，创建一个立方体盒子同时使蛋白质置于盒子中心，使用水模型添加溶剂，紧接着中和电荷使整个体系达到平衡状态；采用最速下降法对整个系统进行能量最小化，以保证结构正常、原子间距离合适以及几何构型合理；然后，在周期边界条件下进行400ps的位置限制性预平...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏小乐，张泽华，龙梦飞，高玲，王颖妤，郑楠，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：