一种硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测方法，属于硫酸盐还原菌的检测技术领域。本发明专利技术公开的一种硫酸盐还原菌的快速检测方法，包括提取样品DNA；以提取的DNA为模板，利用引物DsrB

【技术实现步骤摘要】
一种硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测方法


[0001]本专利技术涉及硫酸盐还原菌的检测
，更具体的说是涉及一种硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测方法。

技术介绍

[0002]硫酸盐还原菌(SRB)是一类能把亚硫酸盐、硫代硫酸盐、硫酸盐和单硫还原为硫化物的微生物，这类微生物可分为自养型和异养型，异养型硫酸盐还原菌通常是严格厌氧菌。硫酸盐还原菌在自然界中分布范围广泛，常见于土壤、海水、地下管道和输油管道等环境中。
[0003]硫酸盐还原菌是造成微生物腐蚀(MIC)的典型代表，广泛存在于油气田地层水、采出水、海洋水、土壤、地下采油管道内壁和油气开采井等厌氧环境中。在油田注水系统的管道设备中，SRB能在厌氧条件下大量繁殖，产生大量黏液状胞外聚合物(EPS)，在管道内壁形成一层厚的生物膜垢，造成注水管道的堵塞，并在管道设施中造成严重的局部腐蚀。在发生微生物腐蚀时，其主要的矿化产物是CaCO3与FeS。SRB除了自身的腐蚀破坏性，常常诱发管道的应力腐蚀开裂(SCC)、缝隙腐蚀、疲劳裂纹尖端脆化和沉积下腐蚀，极易引发油气井堵塞和油气管道泄漏事故。
[0004]目前最常用的检测SRB的方法是最大可能数法(MPN法)，该培养法是指将乳酸钠为碳源，酵母粉为营养源，硫酸根离子作为电子受体的选择性培养基，将梯度稀释后的SRB水样接种加入到其中，用硫酸亚铁作为指示剂确定SRB的存在，但此方法耗时过长，一般需要两周的时间。对于在页岩气开采过程中出现的腐蚀情况将会处理相对不及时。因此需要寻求一种可以实时分析SRB含量的检测方法，以及时采取防腐措施，防止管道腐蚀，保障工业的正常运行。
[0005]随着qPCR技术的兴起，很多微生物的定量分析都依靠此种技术，且qPCR技术耗时既短准确度也较高。
[0006]因此，提供一种针对页岩气采出水中硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测方法，利用该引物定量检测页岩气开采过程中的采出水中硫酸盐还原菌的数量。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种硫酸盐还原菌的检测引物，所述引物序列如下：
[0010]DsrB
‑
F：5
’‑
GCCTGCTGYCTGAACATGTG
‑3’
；SEQ ID NO.1；
[0011]DsrB
‑
R：5
’‑
GTAGCAGTTACCGCAGWACATGC
‑3’
；SEQ ID NO.2；
[0012]其中，Y代表C/T；W代表A/T。
[0013]进一步，一种硫酸盐还原菌的快速检测方法，具体步骤如下：
[0014](1)提取样品DNA；
[0015](2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用引物DsrB
‑
F和DsrB
‑
R进行qPCR扩增；
[0016]所述qPCR扩增的反应体系共20μL，具体如下：DNA 2μL，Master qPCR Mix 10μL，0.4μM DsrB
‑
F 0.8μL，0.4μM DsrB
‑
R 0.8μL，ddH206.4μL；
[0017]所述qPCR扩增的反应程序如下：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环后最终在60℃终延伸5min；
[0018](3)根据标准曲线Y＝
‑
3.16X+34.45计算硫酸盐还原菌的数量。
[0019]对于硫酸盐还原微生物群落，当dsr基因编码异化的亚硫酸盐还原酶是催化亚硫酸盐转化为硫化物的关键酶。本专利技术建立了一种快速测量油田样品中dsrB的定量快速分析方法，可以为苛刻环境样品中亚硫酸盐还原酶基因的丰度提供有价值的信息。
[0020]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测方法，利用本专利技术设计的引物，可以快速准确定量检测水样中是否含有硫酸盐还原菌及硫酸盐还原菌的数量；本专利技术首次利用该方法定量检测四川地区页岩气开采过程中的采出水中硫酸盐还原菌的数量。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0022]图1附图为本专利技术水样DNA的琼脂糖凝胶电泳结果；
[0023]其中，M为DL2000 Marker；1为水样；
[0024]图2附图为本专利技术扩增曲线；
[0025]其中，1、2、3为3个重复；4为基线；
[0026]图3附图为本专利技术熔解曲线；
[0027]其中，1、2、3为3个重复；4为基线；
[0028]图4附图为本专利技术梯度稀释的标准样品qPCR扩增反应后的扩增曲线；
[0029]其中，1
‑
3、4
‑
6、7
‑
9、10
‑
12、13
‑
15、16
‑
18、19
‑
21依次为未稀释、稀释了10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6倍的标准样品，每个稀释梯度3个重复；22为基线；
[0030]图5附图为本专利技术对标准样品进行MPN培养计数的结果；
[0031]其中，1
‑
7分别为未稀释、稀释了10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6倍的标准样品；1
’‑7’
分别为未稀释、稀释了10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6倍的标准样品；1
”‑
7”分别为未稀释、稀释了10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6倍的标准样品；1、1
’
、1”为3个重复，依次类推；
[0032]图6附图为本专利技术的标准曲线。
具体实施方式
[0033]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0034]实施例1...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种硫酸盐还原菌的检测引物，其特征在于，所述引物序列如下：DsrB
‑
F：5
’‑
GCCTGCTGYCTGAACATGTG
‑3’
；SEQ ID NO.1；DsrB
‑
R：5
’‑
GTAGCAGTTACCGCAGWACATGC
‑3’
；SEQ ID NO.2；其中，Y代表C/T；W代表A/T。2.一种硫酸盐还原菌的快速检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)提取样品DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰贵红，刘萌，徐波，陈祉伊，邱海燕，王顺慧，
申请(专利权)人：西南石油大学，
类型：发明
国别省市：