本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控棉花纤维长度的基因及其应用。该基因为GhHD7基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过对棉花中GhHD7基因碱基的插入或缺失来实现棉花中GhHD7基因的表达量降低，得到的转基因棉花植株纤维长度显著变短。本发明专利技术为培育高品质棉花提供了有利的基因资源。育高品质棉花提供了有利的基因资源。育高品质棉花提供了有利的基因资源。
【技术实现步骤摘要】
一种调控棉花纤维长度的基因及其应用
[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种调控棉花纤维长度的基因及其应用。
技术介绍
[0002]棉花是世界上最重要的经济作物之一，是天然纤维的重要来源，我国是主要的棉花生产和纺织品出口大国，棉花在国民经济中占有重要地位。近年来，随着社会经济的不断发展，世界人口的快速增加，可耕地面积的迅速减少，粮棉争地的矛盾日益激化，加之与粮食生产相比，棉花在栽培管理方面耗时费力，且生产成本居高不下，使得农民种植棉花的积极性大减，进而出现棉花种植面积大幅度下降的趋势。随着技术的发展和生产的需求，传统的常规育种已经不能满足人们对棉纤维品质和产量的要求，亟需通过新的技术和方法来挖掘具有优异品质的棉花种质资源，并对其进行深入研究，以便为后续棉花品种的培育和发展提供丰富的种质资源和选择基础。
[0003]随着棉花基因组测序工作的完成，我们可以选择更多的生物学工具去研究棉花的基因组功能。近年来，利用基因编辑研究基因的功能成为热点。CRISPR/Cas9系统作为一种最新的基因组编辑技术，由于具有简单、高效、灵活、低廉的优点，自从出现以来就被广泛应用于多种物种的基因和基因组编辑研究。本专利技术拟对基因GhHD7的敲除材料的棉花纤维发育中的功能进行研究，进一步完善棉花纤维发育伸长的分子机制，为提高棉花纤维品质提供新的策略。
技术实现思路
[0004]本专利技术的第一个方面，提供一种调控棉花纤维长度的基因，该基因为GhHD7基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0005]本专利技术的第二个方面，提供用于敲除所述基因的载体，是将sgRNA序列串联tRNA后连接到pRGEB32
‑
Cas9基因编辑载体上获得的，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0006]本专利技术的第三个方面，提供携带所述重组载体的宿主菌。
[0007]进一步的，该宿主菌为农杆菌GV3101。
[0008]本专利技术的第四个方面，提供所述基因在调控棉花纤维伸长发育中的应用中的应用，通过降低棉花中GhHD7基因的表达量，使其纤维长度变短。
[0009]进一步的，所述降低棉花中GhHD7基因的表达量通过对所述棉花中GhHD7基因碱基的插入或缺失来实现的。
[0010]更进一步的，所述应用包括：将所述的宿主菌转化至受体棉花，得到T0代阳性单株，在T1代
‑
T2代筛选目标编辑位点的碱基缺失或增加的突变体。
[0011]更进一步的，所述受体棉花品种为陆地棉R15。
[0012]本专利技术的有益效果：
[0013]本专利技术首次提供了一种用调控棉花纤维长度的基因，利用CRISPR/Cas9技术敲除GhHD7基因所得的转基因棉花植株纤维长度显著变短，表明GhHD7基因在棉花纤维发育的起始和伸长具有关键作用。本专利技术为培育高品质棉花提供了有利的基因资源。
附图说明
[0014]图1为重组载体结构图。
[0015]图2为GhHD7基因敲除载体构建单克隆测序结果。
[0016]图3为T2代棉花植株Cas9片段的电泳检测结果。
[0017]图4为T2代棉花植株GhHD7基因编辑位点的电泳检测结果。
[0018]图5为T2代棉花植株单菌落PCR鉴定结果，A为菌落图，B为电泳检测结果。
[0019]图6为T2代棉花植株三个株系目标编辑位点的测序结果。
[0020]图7为T2代棉花植株与野生植株0DPA胚珠的扫描电镜图。
[0021]图8为T2代棉花植株与野生植株胚珠数目统计图。
[0022]图9为野生植株(A)与T2代棉花植株(B)中GhHD7基因的相对表达量。
[0023]图10为T2代棉花植株与野生植株的绒长表型比较图。
[0024]图11为T2代棉花植株与野生植株的纤维长度比较图。
具体实施方式
[0025]下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026]在本专利技术的下述实施例中，所用的受体材料为陆地棉R15。
[0027]实施例1：重组载体的构建及农杆菌介导的遗传转化
[0028]1、在GhHD7基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)编辑位点设计并合成tRNA和sgRNA；
[0029]tRNA(SEQ ID NO.3)序列是：5'
‑
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
‑
3'；
[0030]sgRNA(SEQ ID NO.4)序列是：5'
‑
GATAATGCGTGAGAGTTTGG
‑
3'。
[0031]2、将sgRNA序列串联tRNA后连接到pRGEB32
‑
Cas9基因编辑载体上，构建的重组载体图如图1所示。
[0032]3、重组载体构建之后转入大肠杆菌后，采用引物pG32
‑
U6
‑
F和pG32
‑
Ubi2
‑
R进行PCR验证测序(图2所示，灰色部分为GhHD7打靶位点)，测序成功之后提取质粒，再将质粒转入农杆菌(农杆菌GV3101)，然后进行棉花遗传转化，得到3个T0代阳性单株。
[0033]pG32
‑
U6
‑
F(SEQ ID NO.5)序列为：5'
‑
CTTCGGGGACATACTTCAGG
‑
3'；
[0034]pG32
‑
Ubi2
‑
R(SEQ ID NO.6)序列为：5'
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TGTTGGTCGCCGTTAGGACC
‑
3'。
[0035]实施例2：GhHD7基因敲除棉花T2代Cas9片段的检测及编辑位点的检测
[0036]1、取实施例1中T0代阳性植株收获的种子，种植，获得T1代植株，再在T1代株系中，收获种子种植，获得GhHD7基因敲除棉花T2代植株(以下简称为T2代)。
[0037]将T2代和WT(R15)进行取样，取样部位为幼嫩叶片，共3个株系，285个单株，提取
DNA，用Cas9片段特异引物(表1所示)进行扩增，扩增体系如表2，扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，35cycle；72℃，10min；4℃，∞。然后电泳检测，结果如图3所示，从检测结果可知，T2代发生分本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种调控棉花纤维长度的基因，其特征在于，该基因为GhHD7基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.用于敲除权利要求1所述基因的重组载体，其特征在于，是在GhHD7基因编辑位点设计并合成sgRNA，将sgRNA序列串联tRNA后连接到pRGEB32
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Cas9基因编辑载体上获得的，所述tRNA序列如SEQ ID NO.3所示，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.携带权利要求2所述重组载体的宿主菌。4.根据权利要求3所述的宿主菌，其特征在于，该宿主...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴翠翠，杨六六，肖水平，夏芝，丁霄，潘转霞，兰刚，曹彩荣，
申请(专利权)人：江西省棉花研究所，
类型：发明
国别省市：
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