三樟黄贡椒叶绿体基因组及其应用制造技术

本发明专利技术首次公开三樟黄贡椒的叶绿体基因组，并将其应用于三樟黄贡椒的系统发育研究，解析三樟黄贡椒在辣椒属中的系统发育地位。本发明专利技术利用分子系统学和系统发育基因组学方法，通过三樟黄贡椒叶绿体基因组建立辣椒属物种的系统发育关系，在此基础上，利用三樟黄贡椒叶绿体全基因组作为辣椒属的一个超级DNA条形码，用于鉴别三樟黄贡椒的品种。为辣椒属，特别是三樟黄贡椒种质资源的保护、物种鉴定提供理论基础和技术支撑，对于三樟黄贡椒的育种以及遗传多样性评价、保护与利用具有重要意义。保护与利用具有重要意义。保护与利用具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
三樟黄贡椒叶绿体基因组及其应用


[0001]本专利技术属于基因
，具体涉及三樟黄贡椒叶绿体基因组及其应用。

技术介绍

[0002]随着社会的发展，人类对生物多样性的探索、生物资源的合理利用和物种的快速鉴定的需求日益迫切，DNA条形码技术应运而生。DNA条形码是指用于物种鉴定的一段标准的DNA序列，类似于条形码区分商品的DNA条形码，用于区分物种。例如使用线粒体细胞色素氧化酶亚基1(cytochrome oxidase I，COI)基因的一个长约680bp的片段可鉴定两百多种鳞翅目昆虫物种。每个物种都具有区别于其它物种的DNA序列，通过样本的DNA序列与数据库中的参考序列库进行比对，即可鉴定样品属于哪个物种。DNA条形码技术的核心目的是确定未知样本所属的物种，可用于如植物鉴定、生态评估、生物多样性检测、生物安全检测和保护生物学研究等需要知道生物物种的任何领域。
[0003]随着研究的不断深入，DNA条形码的概念由最初单一序列的常规DNA条形码发展到基因组水平超级条形码。虽然目前有众多学者提出了各种用于植物鉴定的DNA条形码，但是由于常规条形码的长度短，信息量有限，导致对近期分化的物种鉴别能力欠佳。使用叶绿体全基因组序列作为超级DNA条形码来鉴定物种，可以显著提高鉴别效率，尤其是亲缘关系较近的物种，并已有不少成功先例。
[0004]植物常规的DNA条形码序列除了少部分为核DNA外，多来自于叶绿体DNA。被子植物的叶绿体基因组是环状双链，可进行半独立的复制和转录。叶绿体基因组大多为母系遗传，结构保守，漫长的进化历程已经使它与线粒体基因组和核基因组形成统一体，共同保持物种的独特性，从而提供物种的系统发育分析信息。
[0005]叶绿体基因组比核基因组小，有较高的种间差异和较低的种内差异。与常规的DNA条形码相比，叶绿体全基因组作为物种鉴定的超级DNA条形码，能提供更多的变异位点和遗传信息，分辨力更强。
[0006]以辣椒属植物为例，在分子层面上，先前的研究者大多是运用常规的分子标记，对属内个别种的种间关系进行了研究，标记类型有RFLP(宋小丽等，2008)、RAPD(李晴等，2010)、SSR(周晶等，2009)等的报道，这些标记主要利用核基因组的多样性分子进化信息，通过PCR在多物种中验证得到。但目前匮乏系统发育关系的全面研究。
[0007]三樟黄贡椒是我国湖南衡东土菜三宝之一，更是衡东土菜之魂。衡东县种植黄贡椒已有400多年的历史。但三樟黄贡椒存在品种杂、乱、多的现状，不同种类的辣椒之间，仅靠形态特征已经无法完成系统分类。随着分子生物学的迅猛发展，从基因组水平上对植物进行分子分型，即利用分子手段对辣椒进行分类是行之有效的手段。由于相比于核基因组，叶绿体基因组相对比较保守，所以利用叶绿体基因组进行分析进行物种系统发育研究更为精确。目前尚无三樟黄贡椒叶绿体基因组的研究和报道。而且由于二代及三代测序技术的发展和测序成本的降低，利用测序进行物种鉴别将称为未来发展趋势。本专利技术旨在利用三樟黄贡椒整个叶绿体基因组作为DNA条形码，用于鉴别三樟黄贡椒的品种。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的之一在于提供三樟黄贡椒叶绿体基因组，用以填补现有技术的基因组数据库没有三樟黄贡椒叶绿体基因组序列的空白。
[0009]本专利技术的目的之二在于提供三樟黄贡椒叶绿体基因组鉴定三樟黄贡椒品种以及重建辣椒属系统发育树中的应用，为三樟黄贡椒种质资源的保护、物种鉴定提供技术支撑。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采取如下技术方案：
[0011]本专利技术提供一种三樟黄贡椒叶绿体基因组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；大小为156759bp，总GC含量为37.73％；包含一对25775bp大小的反向重复序列，GC含量为43.06％；一个大小为17831bp的小单拷贝区域，GC含量为32.04％；一个大小为87378bp的大单拷贝区域，GC含量为35.74％。整个叶绿体基因组总共有131个基因得到注释，包含85个蛋白编码基因，38个转运RNA基因，8个核糖体RNA基因。
[0012]本专利技术还提供了上述三樟黄贡椒叶绿体基因组在鉴定三樟黄贡椒和/或重建已知辣椒属系统发育树中的应用。将三樟黄贡椒整个叶绿体基因组作为DNA条形码，用于鉴别三樟黄贡椒的品种，由于叶绿体基因组包含更多的遗传信息，其鉴定结果更加准确。
[0013]本专利技术还公开了一种三樟黄贡椒品种鉴定方法，所述鉴定方法包括：
[0014](1)采用CTAB法提取样品总DNA提取；
[0015](2)对提取的总DNA进行Oxford Nanopore PromethION三代测序及IlluminaNovaSeq高通量二代测序；
[0016](3)叶绿体基因组拼接和组装；
[0017](4)将组装好的样品叶绿体基因组核苷酸序列与三樟黄贡椒的叶绿体基因组核苷酸序列进行比对，当其相似指数达到99.95％以上时，即确定为三樟黄贡椒。
[0018]更加优选地，当组装好的样品叶绿体基因组核苷酸序列与三樟黄贡椒的叶绿体基因组核苷酸序列进行比对，当其序列完全一致，也就是相似指数为100％时，确定该样品一定为三樟黄贡椒。
[0019]具体地，步骤(3)所述叶绿体基因组拼接和组装的方法具体为：
[0020]1)使用Flye(version：v.2.8.3；参数：
‑
meta
‑
plasmids)软件对高通量测序数据进行de novo组装；
[0021]2)基于已经公开发表的辣椒属叶绿体基因组序列作为参考序列，将拼接结果进行blasm(version：2.2.30+；参数：
‑
evalue le
‑
5)比对，基于比对情况并确定候选序列组装结果；
[0022]3)连接好的序列，若包含gap(含N序列)，则使用Gapcloser(version：1.12)进一步补洞，完成叶绿体基因组的拼接和组装，并进行人工校对；
[0023]4)利用专门针对叶绿体的注释软件CPGAVAS2进行基因注释后并绘图，从而获得完整的三樟黄贡椒叶绿体基因组，利用DOGMA软件绘制叶绿体基因组注释图。
[0024]为了研究三樟黄贡椒的系统发育位置，将得到的三樟黄贡椒叶绿体基因组和从NCBI网站下载到的12个代表性辣椒属物种的叶绿体基因组进行比对，
[0025]通过ModelFinder软件，基于BIC(Bayesian information cfiterion)标准筛选最佳模型；利用RAxML软件，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)，自展值设置1000次重复，进行系统发育树重建，得到基于叶绿体基因组的辣椒属系统发育树。
[0026]本专利技术具有如下优点：
[0027]本专利技术首次公开了三樟黄贡椒的叶绿体基因组，并将其应用于三樟黄贡椒的系统发育研究中，解析了三樟黄贡椒在辣椒属中的系统发育地位。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.三樟黄贡椒叶绿体基因组，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的三樟黄贡椒叶绿体基因组在鉴定三樟黄贡椒品种中的应用。3.权利要求1所述的三樟黄贡椒叶绿体基因组在重建辣椒属系统发育树中的应用。4.一种三樟黄贡椒品种鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括：(1)采用CTAB法提取样品总DNA提取；(2)对提取的总DNA进行Oxford Nanopore PromethION三代测序和Illumina NovaSeq高通量二代测序；(3)叶绿体基因组拼接和组装；(4)将组装好的样品叶绿体基因组核苷酸序列与三樟黄贡椒的叶绿体基因组核苷酸序列进行比对，当其相似指数达到99.95％以上时，才确定为三樟黄贡椒。5.根据权利要求4所述的三樟黄贡椒品种鉴定方法，其特征在于，步骤(4)将组装好的样品叶绿体基因组核苷酸序列与三樟黄贡椒的叶绿体基因组核苷酸序列进行比对，当其序列完全一致时，确定为三樟黄贡椒。6.根据权利要求4或5所述的三樟黄贡椒品种鉴定方法，其特征在于，步骤(3)所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐可兰，刘志华，余席茂，马璐，李健生，文明英，刘阳华，唐锷，谭美丽，肖昌华，陈琳，何振华，刘剑眉，谭建军，李建忠，文立丰，
申请(专利权)人：衡阳市蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：