一种非洲猪瘟病毒均相检测反应试剂及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒均相检测反应试剂及检测方法，均相反应试剂盒包括试剂A、试剂B。当试样中的非洲猪瘟病毒与试剂A、试剂B种特异抗体结合形成免疫反应结合物，就将荧光供体和荧光受体形成荧光共振体，供体在激发光激发下，受体发射共振荧光。受体发射的共振荧光强度直接与试样中的非洲猪瘟病毒含量有关。该方法无需包埋、分离，可减少在除弃游离标记物的过程影响检测准确性的干扰因素，使检测的准确性和敏感性得到提高。准确性和敏感性得到提高。准确性和敏感性得到提高。

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒均相检测反应试剂及检测方法


[0001]本专利技术属于均相免疫分析
，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒均相检测反应试剂及检测方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染性疾病。ASFV形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别还有一层脂质包膜和蛋白质衣壳。衣壳由8280个主要的衣壳蛋白p72和60个戊蛋白构成，此外至少有三种蛋白质通过对临近蛋白的粘连来保持衣壳结构的稳定。
[0003]其临床特征主要为全身出血、呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征，发病率和死亡率高，对养猪业的危害巨大。且目前尚无有效的疫苗和特效抗病毒药物可以有效的在疫情爆发时及时控制病毒的传播，主要通过检疫后扑杀来控制其爆发和流行。因此，建立科学有效的检测诊断方法对于非洲猪瘟的防范具有重要意义。
[0004]根据抗原抗体反应后是否需要将免疫结合的标记物和未免疫结合的游离标记物进行分离进行分类，将免疫分析技术分为均相免疫分析和非均相免疫分析。目前免疫分析技术金标、酶标、时间分辨荧光以及化学发光均属于非均相免疫分析方法。均相免疫分析不需要包埋、冲洗等多种除弃未免疫结合的游离标记物步骤，免除了包埋、分离繁琐的操作，更主要是可大大减少在除弃未免疫结合的游离标记物的过程中带来影响检测结果准确性的干扰因素。因此近年来，基于荧光共振能量转移原理的新建立的均相免疫分析方法，以其简捷、准确的操作和低廉的成本，受到广泛关注。
[0005]时间分辨荧光免疫分析(time
‑
resolved fluoroim
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munoassay，TRFIA)属于荧光免疫分析，是1979年由Soini和Hemmila首次提出，他们将稀土离子用于标记技术，很好的避免了荧光免疫分析中生物材料的自发荧光和荧光染料的易淬灭性的问题，建立了继放射免疫定量测定之后的在标记免疫分析领域具有里程碑意义的一种高灵敏免疫分析技术。
[0006]荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量共振转移给受体，使受体发射荧团之间，如果一个荧光基团(供体的发射光谱)与另一个荧光基团(受体的吸收光谱)部分有效重叠，当这两个基团间的距离满足能量交换条件时(一般小于10nm)，供体和受体之间发生能量共振能量传递，即供体在激发光激发下，电子从基态能级跃迁到高激发态，返回基态过程中，将部分激发能量传给相邻的受体，使受体发出荧光。而供体和受体的发射的荧光信号强弱直接与能产生共振的供体和受体的量相关。此方法具有优良的特异性，可消除非特异反应产生的背景荧光信号。
[0007]目前非洲猪瘟病毒检测方法较多，例如非洲猪瘟病毒酶标检测试剂，由于结合的和游离的标记物靠清洗进行分离，在清洗过程将非游离标记物也随之清洗掉，且清洗过程很容易产生不一致性，或清洗不干净，游离标记物产生背景影响，直接导致影响检测的灵敏
度。
[0008]本专利技术与CN201711203146.6的原理和检测方法都不相同，本专利技术的能量共振的特异性更强，利于检测的灵敏度的提升。

技术实现思路

[0009]为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种非洲猪瘟病毒均相检测反应试剂及试剂盒及检测方法，该检测方法采用均相时间分辨荧光技术来检测非洲猪瘟病毒，灵敏度高，特异性强，操作高效方便，无需分离游离的标记物和非游离的标记物，无需清洗，适用于现场检测，且采用些方法便于实现高通量检测。
[0010]解决以上技术问题的一种非洲猪瘟病毒均相检测试剂，其特征在于：包括有反应试剂A和反应试剂B，
[0011]所述反应试剂A由作为荧光供体的式Ⅳ所示镧系穴状化合物和偶联的捕获非洲猪瘟病毒抗体分子组成；
[0012][0013]所述反应试剂B由作为荧光受体的别藻蓝蛋白和偶联的检测分子组成；所述检测分子为非洲猪瘟病毒抗体。
[0014]所述非洲猪瘟病毒抗体为针对非洲猪瘟病毒的任意特异抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；所述捕获分子与所述检测分子相同或不同。
[0015]所述反应试剂B所述检测分子为非洲猪瘟病毒任意特异抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；所述捕获分子与所述检测分子相同或不同。
[0016]其优选：所述反应试剂A以反应试剂A溶液的形式存在；其中反应所述捕获分子使用的是一株单克隆抗体，所述检测分子使用的是另一株单克隆抗体。
[0017]所述反应试剂A以反应试剂A溶液的形式存在。
[0018]所述反应试剂B以反应试剂B溶液的形式存在。
[0019]所述反应剂的一种非洲猪瘟病毒均相检测方法，其特征在于；包括如下步骤：
[0020](1)试剂A、检测样本和试剂B需要按比例配置反应；优选：1:2:1比例进行免疫反应。
[0021](2)试剂A、检测样本和试剂B同时反应或有序反应，优选：试剂A、检测样本先进行免疫反应，再与试剂B反应。
[0022]采用时间分辨荧光检测技术分别检测615nm和665nm中心波长的荧光检测信号。
[0023]本专利技术中采用0.05mg/ml的非洲猪瘟P30蛋白标准品用缓冲液至少稀释三个梯度
样本，即10、100、1000倍稀释，再分别进行615nm和665nm时间分辨荧光检测，采用665nm/615nm和标准品的浓度作标准曲线。
[0024]本专利技术中方法对家猪、野猪进行非洲猪瘟病毒含量检测。
[0025]优化方案中所述反应试剂A中，式Ⅰ所示镧系穴状化合物和捕获分子可通过链霉亲和素
‑
生物素系统偶联。
[0026]所述链霉亲和素
‑
生物素系统偶联具体可通过如下步骤进行：
[0027](1)将式Ⅰ所示镧系穴状化合物标记到链霉亲和素上，得到式Ⅱ所示镧系穴状化合物——链霉亲和素；
[0028][0029][0030](2)将生物素偶联所述捕获非洲猪瘟病毒抗体，得到捕获抗体—生物素偶联物。
[0031]所述试剂A为：镧系穴状化合物
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链霉亲和素中的链霉亲和素和所述捕获抗体
‑
生物素中的生物素特异性结合，得到所述试剂A(式Ⅲ所示)。
[0032][0033]在本专利技术的具体实例中，利用生物素标记试剂盒偶联捕获分子。
[0034]进一步优化方案中，所述反应试剂B中，别藻蓝蛋白和检测分子可利用别藻蓝蛋白
标记试剂盒偶联检测分子。
[0035]所述非洲猪瘟病毒抗体可为针对非洲猪瘟病毒的任意抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。
[0036]所述捕获分子与所述检测分子可相同或不同。
[0037]在本申请具体实例中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒均相检测试剂，其特征在于：包括有反应试剂A和反应试剂B，所述反应试剂A由作为荧光供体的式Ⅳ所示镧系穴状化合物和偶联的捕获非洲猪瘟病毒抗体分子组成；所述反应试剂B由作为荧光受体的别藻蓝蛋白和偶联的检测分子组成；所述检测分子为非洲猪瘟病毒抗体。2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒均相检测试剂，其特征在于：所述非洲猪瘟病毒抗体为针对非洲猪瘟病毒的任意特异抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；所述捕获分子与所述检测分子相同或不同。3.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒均相检测试剂，其特征在于：所述反应试剂B所述检测分子为非洲猪瘟病毒任意特异抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；所述捕获分子与所述检测分子相同或不同。4.根据权利要求1所述，其优选：所述反应试剂A以反应试剂A溶液的形式存在；其中反应所述捕获分子使用的是一株单克隆抗体，所述检测分子使用的是另一株单克隆抗体。5.根据权利要求2所述，所述反应试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴冠英，章健，白雪欣，吴俊清，郭廷翘，王泽洲，陈斌，李敏，谭立华，陈弟诗，黄云川，
申请(专利权)人：杭州大瑞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：