一种利用全外显子测序检测肝细胞癌的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用全外显子测序检测肝细胞癌的方法，包括如下步骤：S1、肝癌细胞基因组DNA提取：采用试剂盒及标准DNA提取方法提取基因组DNA；S2、基因捕获：基因组DNA经超声处理打断、末端修复、接头连接、杂交捕获、PCR扩增；S3、测序：高通量测序采用Illumina Solexa平台进行全外显子测序；S4、数据分析：对数据进行标准信息分析，同时对数据进行质控检测；S5、筛选：将所得数据与数据库进行比对，得到高可性、高质量SNP、Indel；S6、结果生物信息分析：确定相应基因片段的突变位置及突变类型，并进行生物学分析。所述方法可以便于进行肝细胞癌诊断，利于后续肝细胞癌信号机制研究。利于后续肝细胞癌信号机制研究。

【技术实现步骤摘要】
一种利用全外显子测序检测肝细胞癌的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，更具体地，涉及一种利用全外显子测序检测肝细胞癌的方法。

技术介绍

[0002]肝细胞癌((hepatocellular carcinoma，HCC))是一种高死亡率的原发性肝癌。它是一种全球范围最常见的恶性肿瘤，尤其是在亚洲、非洲和南部欧洲。肝细胞癌是肝癌的主要组织学亚型，占原发性肝癌的90％，是全世界癌症相关死亡率的第三大常见原因。遗传、表观遗传改变、慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素暴露、吸烟、肥胖和糖尿病等是肝癌的主要危险因素。肝癌预后差的原因是复发率和转移率高。肝细胞癌的生产及其转移的机制非常复杂，目前仍是医学上渴望重点攻克的的难题之一。现代医学发现，基因的改变影响着所有的疾病发生发展。而基因突变可能会使蛋白质发生改变，包括理化性质、生物化学性质、免疫学性质及生物功能学的改变、或使其蛋白质的量改变，从而导致疾病的发生，基因突变以及其突变影响相应蛋白质或相应分子通道调节异常的途径与疾病之间的关系是现在研究的重点。
[0003]大部分基因功能由外显子承担(expressed region)，外显子是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列，又称表达序列。既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。术语外显子也指编码相应RNA外显子的DNA中的区域。所有的外显子一同组成了遗传信息，该信息会体现在蛋白质上。在人类基因中大约有180000个外显子，占人类基因组的1％，约30MB，人类基因组的蛋白编码区域大约包含85％的致病突变。
[0004]外显子测序(WES)是指运用核酸序列捕获技术将基因组外显子区域的DNA捕捉并富集后，再构建文库进行NGS测序分析。在对基因的SNP改变、插入缺失具有独特的优势。外显子测序在对多个个体的蛋白编码测序时，有覆盖度更深、准确性高、简单方便等优势，且外显子测序只针对人类基因组序列的1％。然而，现今肝细胞癌及相关基因的表达尚不清楚，若能将外显子测序应用于探查肝细胞癌组织的突变基因及相应的突变位点，肝细胞癌的个性化治疗提供分子手段对于临床上肝细胞癌的诊断治疗将有巨大的指导意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种利用全外显子测序检测肝细胞癌的方法，所述检测肝细胞癌的方法可以筛选出与肝细胞癌密切目标基因与基因上的SNP位点，便于进行肝细胞癌诊断，肝细胞癌的个性化治疗提供分子手段便于后续明确肝细胞癌信号机制的研究，也能为肝细胞癌的个性化治疗提供分子手段。
[0006]本专利技术采取的技术方案如下：
[0007]一种利用全外显子测序检测肝细胞癌的方法，包括如下步骤：
[0008]S1、肝癌细胞基因组DNA提取：采用试剂盒及标准DNA提取方法提取基因组DNA；
[0009]S2、基因捕获：基因组DNA经超声处理打断、末端修复、接头连接、杂交捕获、PCR扩增；
[0010]S3、测序：高通量测序采用Illumina Solexa平台进行全外显子测序；
[0011]S4、数据分析：对数据进行标准信息分析，同时对数据进行质控检测；
[0012]S5、筛选：将所得数据与数据库进行比对，得到高可性、高质量单核苷酸变异、小片段序列插入以及缺失；
[0013]S6、结果生物信息分析：确定相应基因片段的突变位置及突变类型，并进行生物学分析。
[0014]优选地，所述步骤S1具体过程为：采用QIAamp基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA：
[0015]S1.1血液样本解冻，吸取200ul血样加入20ul蛋白K溶液混匀；加入200ul缓冲液GB，充分震荡15s，70℃放置10min，简单离心去除管盖内壁水珠；再加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15s；简单离心后使溶液转移到2mL离心柱上；
[0016]S1.2将离心柱12000rpm离心30s，倒掉废液，将离心柱转移到新的离心管中；
[0017]S1.3向新的离心管中加入500ul漂洗液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，再次换离心管；
[0018]S1.4再次加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，再更换离心管，重复本步骤一次；
[0019]S1.5将更换后的离心管于12000rpm离心2min，倒掉废液，至于置于室温3分钟，晾干材料中残余的漂洗液；往离心柱中滴加200ul洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm离心2min；用分光光度计检测DNA浓度，标准化至50ng/μl，置-30℃保存备用。
[0020]优选地，步骤S2中基因组DNA经超声处理打断得到的为180-250bp的DNA片段。
[0021]优选地，步骤S2中末端修复是在片段DNA 3
’
端连接测序接头A碱基。
[0022]优选地，步骤S2中杂交捕获所采用的捕获试剂盒为Sure Select Human All Exon 50Mb Kit外显子捕获试剂盒。
[0023]优选地，步骤S2中PCR扩增条件为：95℃预变性2min；98℃变性20s，70℃5mim，25～30个循环；得到的扩增产物0℃保存。
[0024]优选地，步骤S3高通量测序后得到原始序列数据。
[0025]优选地，步骤S4数据分析中采用的数据库为单核苷酸多态性数据库、千人基因数据库。
[0026]优选地，步骤S4所述的质控检测包括测序深度、覆盖度均一性、对比率分析。
[0027]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供一种利用全外显子测序检测肝细胞癌的方法，所述检测肝细胞癌的方法可以筛选出与肝细胞癌密切目标基因与基因上的SNP位点，便于进行肝细胞癌诊断，便于后续明确肝细胞癌信号机制的研究，对于疾病的临床诊断和治疗具有重要意义，也能为肝细胞癌的个性化治疗提供分子手段。
具体实施方式
[0028]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例将对本专利技术
的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。
[0029]下述实施例中所用的实验原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例
[0030]研究对象来源如下：3名广州市中山大学某附属医院外科肝细胞癌手术治疗的患者。
[0031]样本采集：采肝细胞癌患者外周血2mL，采用EDTA抗凝低温冷藏保存。
[0032]一种利用全外显子测序检测肝细胞癌的方法，包括如下步骤：
[0033]S1、肝癌细胞基因组DNA提取：采用QIAamp基因组DNA提取试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用全外显子测序检测肝细胞癌的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、肝癌细胞基因组DNA提取：采用试剂盒及标准DNA提取方法提取基因组DNA；S2、基因捕获：基因组DNA经超声处理打断、末端修复、接头连接、杂交捕获、PCR扩增；S3、测序：高通量测序采用Illumina Solexa平台进行全外显子测序；S4、数据分析：对数据进行标准信息分析，同时对数据进行质控检测；S5、筛选：将所得数据与数据库进行比对，得到高可性、高质量单核苷酸变异、小片段序列插入以及缺失；S6、结果生物信息分析：确定相应基因片段的突变位置及突变类型，并进行生物学分析。2.根据权利要求1所述的利用全外显子测序检测肝细胞癌的方法，其特征在于，所述步骤S1具体过程为：采用QIAamp基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA：S1.1血液样本解冻，吸取200ul血样加入20ul蛋白K溶液混匀；加入200ul缓冲液GB，充分震荡15s，70℃放置10min，简单离心去除管盖内壁水珠；再加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15s；简单离心后使溶液转移到2mL离心柱上；S1.2将离心柱12000rpm离心30s，倒掉废液，将离心柱转移到新的离心管中；S1.3向新的离心管中加入500ul漂洗液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，再次换离心管；S1.4再次加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，再更换离心管，重复本步骤一次；S1.5将更换后的离心管于12000rpm离心2min，倒掉废液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志峰，
申请(专利权)人：广州源古纪科技有限公司，
类型：发明
国别省市：