一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法技术

本发明专利技术涉及前列腺癌技术领域，具体地说，涉及一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法。其包括以下步骤：对患者尿液标本进行采集；对尿液标本通过离心机进行处理；采用TRlzol法提取RNA，并对提取的RNA进行纯度分析，用DEPC水稀释并测其浓度；将RNA进行转录组的逆转录与扩增，生成cDNA；S1.5、将cDNA用无酶水稀释10倍后用于实时聚合酶链反应；采用贴壁细胞培养方法进行细胞培养；对细胞进行冻存与复苏；进行统计学分析；该基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法中，LncRNA546可作为前列腺癌早期诊断的新型生物标志物，可根据LncRNA546构建Logistic回归模型，绘制nomogram用于预测患前列腺癌概率。nomogram用于预测患前列腺癌概率。nomogram用于预测患前列腺癌概率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法


[0001]本专利技术涉及前列腺癌
，具体地说，涉及一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法。

技术介绍

[0002]前列腺癌发病率逐年升高，传统的检测PSA的诊断方式特异性较低，导致大量患者进行非必要前列腺穿刺，故而寻找无创的特异性好的早期诊断方式尤为重要。
[0003]早期局限性前列腺癌的5年生存率接近100％，而晚期转移性前列腺癌仅仅为28％，因此早期诊断前列腺癌尤其重要。早期前列腺癌常无任何症状，直肠指检(DRE)、经直肠超声检查(TRUS)联合前列腺特异性抗原(PSA)检查是目前公认的前列腺癌早期筛查方法。
[0004]DRE操作方便，相对无创，但DRE受操作者经验水平影响较大，敏感性较低，且发现时往往已到中晚期，只能作为辅助诊断方式。典型的前列腺癌可在TRUS表现为外周带的低回声结节，通过TRUS可初步判断肿瘤的体积大小及位置，但TRUS对诊断前列腺癌的特异性较低，部分前列腺肿瘤表现为等回声结节，且常需与急性或慢性前列腺炎、前列腺增生(BPH)、前列腺上皮内瘤变(PIN)等鉴别诊断。
[0005]PSA作为单一检测指标，和DRE、TRUS相比，具有更高的阳性诊断率。美国泌尿外科学会(AUA)及美国临床肿瘤学会(ASCO)均建议50岁以上男性应每年例行进行PSA检查，对于有家族史的人群，应该从45岁起常规PSA筛查。由于PSA的应用，前列腺癌的早期诊断率大大提升，死亡人数也逐年下降。然而，血清PSA水平容易受到多种因素的影响，如导尿、膀胱镜检查、DRE、射精、前列腺穿刺、急性前列腺炎、尿潴留等。且当PSA介于4
‑
10ng/ml时，前列腺穿刺阳性率在欧美人群低至25％,在中国人群则更低，大约为15.9％。围绕这一PSA灰区，需要其他额外检查如游离PSA(fPSA)、PSA密度(PSAD)、PSA速率(PSAV)等配合进行以提高诊断阳性率。由于PSA的诊断特异性较低，导致大量非必要的前列腺穿刺活检，由此带来的操作相关并发症和经济及心理负担给患者造成巨大压力。
[0006]目前，许多研究正在寻找合适的生物标志物以帮助前列腺癌早期诊断，PCA3、融合基因TMPRESS:ETS、GSTP1、AMACR、MALAT
‑
1、EPCA、GOLPH2和肌氨酸等被相继报道，但依然存在各种问题。
[0007]本研究拟通过检测多中心样本尿液LncRNA546的含量，探索其作为前列腺癌早期诊断生物标志物的可能性，并尝试建立模型工具将其应用到临床。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，包括以下步骤：
[0010]S1.1、对患者尿液标本进行采集；
[0011]S1.2、对尿液标本通过离心机进行处理；
[0012]S1.3、采用TRlzol法提取RNA，并对提取的RNA进行纯度分析，用DEPC水稀释并测其浓度；
[0013]S1.4、将RNA进行转录组的逆转录与扩增，生成cDNA；
[0014]S1.5、将cDNA用无酶水稀释10倍后用于实时聚合酶链反应；
[0015]S1.6、采用贴壁细胞培养方法进行细胞培养；
[0016]S1.7、对细胞进行冻存与复苏；
[0017]S1.8、进行统计学分析。
[0018]作为本技术方案的进一步改进，所述S1.1中，尿液采集前应多饮水，采集时，先作前列腺按摩，具体步骤如下：患者取胸膝位，术者以惯用手指戴橡皮手套，涂润滑石蜡油先轻柔按摩肛周，后缓慢深入直肠，摸到前列腺后，用食指的最末指节对着直肠前列腺侧，压力使前列腺表面下压1cm，从外向内，从基底部向尖部，对前列腺进行按压，每叶按摩3
‑
4次，再从中央沟自上而下向尿道外口挤压出前列腺液，按摩完后取患者首次前段尿液40
‑
50ml，注意不能使用患者晨尿。
[0019]作为本技术方案的进一步改进，所述S1.2中，尿液标本采集后，立即置于冰上，2小时内将尿液置于低温4℃的离心机上以4000rpm转速离心15min；弃去上清液，用低温保存的PBS洗涤尿沉渣后，再置于低温4℃离心机4000rpm转速离心15min；最后留取尿沉渣，保存存于
‑
20℃或
‑
80℃冰箱，离心完后尿沉渣应该为透明胶状，若为红色或者深红色，则说明杂质较多，不适合接下来的实验分析。
[0020]作为本技术方案的进一步改进，所述S1.3中，TRIzol法提取RNA的具体步骤如下：
[0021]S2.1、将之前保存的尿沉渣标本取出，室温放置5
‑
6min后，置于1.5ml EP管加入1000ul的TRIzol试剂，吹打、震荡混匀；
[0022]S2.2、将上述标本置于于EP管内加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀，室温放置5min，在4℃离心机离心12000rpm转速离心15min，可见液体分为三层，用移液枪吸取上层清凉液体，吸入新的无酶1.5ml EP管；
[0023]S2.3、在新管内加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，并于室温静置10min，在4℃离心机中配平离心10min，转速为12000rpm；
[0024]S2.4、弃去上清液，加入低温预冷的75％乙醇1000ul，上下颠倒混匀，在4℃离心机中配平离心5min，转速为7500rpm；
[0025]S2.5、弃去上清，用移液枪吸掉剩下的少量液体，自然风干10min左右，剩下的管底白色絮状沉淀即为RNA。
[0026]作为本技术方案的进一步改进，所述S1.3中，RNA提取之后纯度分析的具体步骤如下：
[0027]S3.1、琼脂糖凝胶电泳：取0.5
‑
1ug的RNA上样置于1％琼脂糖凝胶，电泳，参数为120V，15min，对于没有降解的RNA可能是2种核糖体RNA，真核细胞：28S和18S，条带亮度约为2:1，但如果核糖体RNA条带弥散，说明可能RNA降解，如果条带超过28S，可能存在基因组DNA污染；
[0028]S3.2、吸光度分析：用DEPC水稀释RNA后用紫外分光光度计测定吸光度，测量230nm
盐、260nm核酸、280nm蛋白和320nm不溶物的吸光值，本实验控制RNA的纯度为OD260/OD280＝1.9
‑
2.1，比值<1.9说明有DNA或蛋白污染，>2.1说明RNA有降解，符合标准后，读取三次Nanodrop的RNA浓度数值，取平均值，提取完RNA后，可用于下面的实验，也可将符合纯度的RNA保存于
‑
80℃冰箱以备下次使用。
[0029]作为本技术方案的进一步改进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.1、对患者尿液标本进行采集；S1.2、对尿液标本通过离心机进行处理；S1.3、采用TRlzol法提取RNA，并对提取的RNA进行纯度分析，用DEPC水稀释并测其浓度；S1.4、将RNA进行转录组的逆转录与扩增，生成cDNA；S1.5、将cDNA用无酶水稀释10倍后用于实时聚合酶链反应；S1.6、采用贴壁细胞培养方法进行细胞培养；S1.7、对细胞进行冻存与复苏；S1.8、进行统计学分析。2.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.1中，尿液采集前应多饮水，采集时，先作前列腺按摩，具体步骤如下：患者取胸膝位，术者以惯用手指戴橡皮手套，涂润滑石蜡油先轻柔按摩肛周，后缓慢深入直肠，摸到前列腺后，用食指的最末指节对着直肠前列腺侧，压力使前列腺表面下压1cm，从外向内，从基底部向尖部，对前列腺进行按压，每叶按摩3
‑
4次，再从中央沟自上而下向尿道外口挤压出前列腺液，按摩完后取患者首次前段尿液40
‑
50ml。3.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.2中，尿液标本采集后，立即置于冰上，2小时内将尿液置于低温4℃的离心机上以4000rpm转速离心15min；弃去上清液，用低温保存的PBS洗涤尿沉渣后，再置于低温4℃离心机4000rpm转速离心15min；最后留取尿沉渣，保存存于
‑
20℃或
‑
80℃冰箱。4.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.3中，TRIzol法提取RNA的具体步骤如下：S2.1、将之前保存的尿沉渣标本取出，室温放置5
‑
6min后，置于1.5mlEP管加入1000ul的TRIzol试剂，吹打、震荡混匀；S2.2、将上述标本置于于EP管内加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀，室温放置5min，在4℃离心机离心12000rpm转速离心15min，可见液体分为三层，用移液枪吸取上层清凉液体，吸入新的无酶1.5ml EP管；S2.3、在新管内加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，并于室温静置10min，在4℃离心机中配平离心10min，转速为12000rpm；S2.4、弃去上清液，加入低温预冷的75％乙醇1000ul，上下颠倒混匀，在4℃离心机中配平离心5min，转速为7500rpm；S2.5、弃去上清，用移液枪吸掉剩下的少量液体，自然风干10min左右，剩下的管底白色絮状沉淀即为RNA。5.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.3中，RNA提取之后纯度分析的具体步骤如下：S3.1、琼脂糖凝胶电泳：取0.5
‑
1ug的RNA上样置于1％琼脂糖凝胶，电泳，参数为120V，15min；S3.2、吸光度分析：用DEPC水稀释RNA后用紫外分光光度计测定吸光度，测量230nm盐、260nm核酸、280nm蛋白和320nm不溶物的吸光值。
6.根据权利要求1所述的基于LncRNA546标志物的前列腺癌早期诊断方法，其特征在于：所述S1.4中，RNA进行转录组的逆转录与扩增的具体步骤如下：S4.1、取50ng纯度达标的RNA，用移液枪移入新的200ul无酶EP管，加入0.5ulLibrary Synthesis Solution，之后加无酶水将体系补至3.32ul，混匀；S4.2、将反应体系置于PCR仪孵育，设置参数70℃，5min
→
18℃，∞；期间配制下一步要使用的Mix混合液：0.4ul Library Synthesis Enzyme加0.5ul Library Synthesis Buffer+0.78ul无酶水；S4.3、在冷却后的反应体系中快速加入步骤2配制好的Mix，混匀；S4.4、PCR仪孵育，设置参数：18℃，10min
→
2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘飞，韩苏军，邢念增，
申请(专利权)人：刘飞，
类型：发明
国别省市：