检测单子叶植物中产生PTI反应的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测植物中产生PTI免疫反应的方法。具体而言涉及一种在单子叶植物中检测PTI的实验体系，该检测方法可实现单子叶植物的抗病反应的检测，操作简单、易于判断，高效、快速，适合大规模筛选。适合大规模筛选。

【技术实现步骤摘要】
检测单子叶植物中产生PTI反应的方法


[0001]本专利技术涉及一种检测植物中产生PTI免疫反应的方法。更具体地，本专利技术涉及一种在单子叶植物中检测PTI免疫反应的方法。

技术介绍

[0002]植物在自然环境中面临大量多样的病原微生物的侵袭。植物抗病性通过两种方式保护植物免受病原体侵害：预先形成的结构(如角质层，细胞壁等)和化学物质(例如，抗菌化学品如糖苷、皂苷，抗菌蛋白及酶抑制剂等)，以及通过感染引起的免疫系统反应来识别和消除病原物。
[0003]植物免疫途径包括两个层面，病原物相关分子模式促发的免疫(PAMP-triggered immunity，PTI)和效应子促发的免疫(effector-triggered immunity，ETI)。
[0004]PTI免疫是植物的基础免疫，植物可通过定位于细胞膜上的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别病原微生物的病原物相关分子模式(pathogen-associated molecular Patterns，PAMPs)，从而促发寄主与病原菌互作早期的免疫反应，抑制病原微生物在植物组织中的定殖。另外，模式识别受体PRRs除可以识别PAMPs之外，也可以识别与损害相关的化合物，即损伤相关分子模式(damage-associated molecular Patterns，DAMPs)。
[0005]PAMPs是微生物的保守特征，在病原微生物及非病原微生物中均存在，因此也被称为微生物相关分子模式(microbe-associated molecular Patterns，MAMPs)。宿主识别PAMPs后会产生一系列的PTI免疫反应，其表现包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生、MAPK的激活、防卫基因的诱导表达、植物抗毒素的产生等。
[0006]目前，得益于对模式植物拟南芥的遗传筛选及功能研究，对植物免疫的分子机制有了很大的了解。但对单子叶植物(包括最重要的粮食作物)的免疫的分子机制的了解仍然滞后。单子叶植物中缺乏有效的植物免疫生物测定方法，是阻碍单子叶植物与病原菌相互作用的研究进展的重要因素。
[0007]水稻(Oryza sativa)是重要的粮食作物，也是重要的单子叶模式植物。目前，检测水稻中产生PTI反应的方法通常利用在水稻悬浮细胞或组织中检测PTI反应的主要指标，如ROS的爆发、MAPK的激活、防卫基因的表达等而进行。
[0008]但这些方法存在以下问题，由于需要进行蛋白质或RNA的提取、及蛋白和利用PCR的检测等，因此过程复杂，耗时，用于大规模筛选时实用性差。
[0009]例如，如果要检测MAPK的激活及防卫基因的表达，则有必要提取蛋白质或RNA，之后进行蛋白质免疫印迹或实时荧光定量PCR检测。一方面，RNA容易降解，整个过程中操作繁琐；另一方面，在样本量庞大时，逐个提取蛋白或RNA的操作需要大量人力、试剂和时间，不适合大规模筛选。而对ROS爆发而言，虽然能够进行快速高效的检测，但目前只能在水稻悬浮细胞中进行，而将需要筛选的水稻株系全部进行细胞培养是十分耗时的工作。在水稻组织或植株中直接进行ROS爆发的检测仍是一大挑战。
[0010]因此，对水稻或其它单子叶植物中是否发生PTI免疫反应，需要一种操作简单、易于判断，高效而可适用于大规模筛选的生物测定方法。

技术实现思路

[0011]专利技术人经过深入研究，建立了在单子叶植物中，不需要进行蛋白质或RNA的提取及蛋白和利用PCR而检测产生PTI免疫反应的方法。该方法基于对单子叶植物的幼苗侧根长度的测定而判断是否出现侧根发育抑制，当确定出现侧根发育抑制时，则判断为产生了PTI免疫反应。
[0012]上述方法的操作简单、易于判断，高效，即使需要筛选的样本总量庞大也易于进行，可直接对植株进行，不需要格外的细胞培养。因此适用于单子叶植物尤其是水稻的大规模筛选，能够节省人力物力，在日本晴、品种中花11、品种黄华占、东乡野生稻等多种品种中均有效果，为一种可靠而适用性高的检测方法。
[0013]通过进一步在上述方法中使用激发物石莼多糖处理植株，即使对于单独处理时造成的抑制效果较小的PAMP也能获得良好的检测效果。
[0014]在本专利技术的实施方式中，专利技术人分别使用作为细菌PAMP的Flg22，作为真菌的PAMP的几丁质及作为损伤相关分子模式DAMP的OG处理水稻幼苗检验了本专利技术的检测方法，证实通过测量是否发生侧根发育抑制，能够有效检测是否发生由这些物质引起的PTI免疫反应。
[0015]作为细菌PAMP的Flg22是来源于细菌菌毛的保守的22个氨基酸的多肽，可以被作为PRR的FLS2识别。FLS2在拟南芥和水稻中均存在，为一个富含亮氨酸重复的受体样激酶。几丁质(几丁质)是目前研究较多的真菌的PAMPs，其来源于真菌细胞壁。据报道，几丁质寡糖能够激活单子叶植物和双子叶植物的免疫反应。在这样的过程中，具体而言，拟南芥中的含有LYK5的受体复合体和水稻中的含有CEBiP及CREK1的受体复合体可以识别几丁质。
[0016]作为DAMP，例如可以列举OG。在拟南芥中，受体激酶WAK1可以识别病原菌侵染或机械损伤造成的细胞壁产生的OGs(寡半乳糖苷，oligogalacturonides)。
[0017]在本专利技术的一个实施方式中，作为单子叶植物使用了日本晴、品种中花11、品种黄华占、野生稻等水稻，但不限于此。作为单子叶植物可列举：小麦、玉米。
[0018]在本专利技术的一个实施方式中，使用了石莼多糖作为激活更强的防卫反应的激发物，但并不限于此，只要是能够激活单子叶植物防卫反应的试剂如β-1,6-1,3-葡聚糖、来源于藻类的多糖等，激发手段(例如机械性损伤，过量光照，特殊波长射线的照射，能够引起晒伤的高温，能够引起冻伤的低温等)，或以上试剂与以上激发手段的组合即可，具体采用的处理时间及浓度可以由本领域技术人员适当地确定。当使用石莼多糖时，浓度例如为20μg/ml，优选为100μg/ml。
[0019]在本专利技术的一个实施方式中，使用了PTI激发因素为实验用激发子(Elicitors)，但并不限于此，也可以为激活PTI反应的其他因素。
[0020]在本专利技术的一个实施方式中，对使用的处理单子叶植物的PTI激发因素的处理时间及试验开始时幼苗的天龄或周龄而言，能够根据试验目的的不同及单子叶植物的种类进行适当调整。当所述单子叶植物为水稻时，例如为日本晴。
[0021]在本专利技术中，侧根长度Llr或侧根长度Llrc是指将植物正常平铺摆放时，从距茎基部下方1.5cm至4.5cm的主根区域上某一侧根发生处到该侧根末端的长度。
[0022]所述侧根长度的测量优选于接种后不超过第8天，优选在接种的第7天进行，第7天观察结果已有明显差异，超出时限后由于培养皿空间限制，不便于后期观察。
[0023]本专利技术中，所述侧根发育抑制指侧根长度的抑制，当测量在PTI激发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测单子叶植物中产生PTI反应的方法，包括用PTI激发因素处理单子叶植物的幼苗，例如水稻、小麦、玉米，优选为水稻，特别优选为选自品种日本晴、品种中花11、品种黄华占、东乡野生稻中的品种的幼苗，测量在PTI激发因素处理后的侧根长度Llr，并与初始萌发情况相似但无PTI激发因素处理的幼苗的侧根长度Llrc相比，p<0.01则认为出现侧根发育抑制，判断为产生了PTI反应。2.根据权利要求1所述的方法，包括在PTI激发因素处理前、或处理过程中使用石莼多糖处理所述幼苗。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，石莼多糖处理的浓度为优选为100μg/ml，处理时间优选为与激发因素共同处理幼苗3～4天。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，侧根长度的测量的统计区域为幼苗主根从上至下1.5～4.5cm的区域。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述PTI激发因素的处理时间为1～5天，优选为3～4天，更优选为4天。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，单子叶植物的幼苗为将种子接种在培养基上后无菌培养到第3天的幼苗，所述侧根长度的测量于接种后不超过第8天，优选在接种的第7天进行。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述培养基为培养基平板，优选为1/2M...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱金龙，王睿，尹康权，张丹丹，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：