一种优化ctDNA检测准确率的方法技术

本申请涉及肿瘤DNA检测领域，具体公开了一种优化ctDNA检测准确率的方法，包括以下步骤：S1、血液样本处理：将血液样本在采血2h内进行以下操作：将血液样本离心，取上层血浆；S2、ctDNA的抽离：向血浆中加入裂解液、蛋白质酶解剂和二氧化硅，混匀，离心，取下层沉淀物，加入EB缓冲液，水浴，取出，在室温下，离心，取上清液作为ctDNA样本，保存；S3、ctDNA样本中间处理：将ctDNA样本回温至1

【技术实现步骤摘要】
一种优化ctDNA检测准确率的方法


[0001]本申请涉及肿瘤DNA检测领域，更具体地说，它涉及一种优化ctDNA检测准确率的方法。

技术介绍

[0002]ctDNA即循环肿瘤DNA，是指由肿瘤细胞坏死、凋亡或者正常分泌到血液中的DNA片段，其携带了癌症相关的基因变异信息，是一种新型的肿瘤生物标志物。
[0003]目前，ctDNA的检测方法主要有无酶PCR反应、DNA测序、基因芯片和酶辅助的PCR扩增，但目前这些方法仍存在一些不足，例如无酶PCR技术易被化学物质影响而产生假阴性或假阳性，而DNA测序法所用仪器设备较为昂贵，且检测时间长，基因芯片的检测成本昂贵，检测灵敏度低，重复性差，酶辅助的PCR扩增法会导致假阳性和非特异性信号，且价格昂贵。
[0004]因ctDNA仅占cfDNAde 0.1
‑
5％，呈高度碎片状，且不同癌种、不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中含量差异较大，因此需要一种超敏感的方法检测在cfDNA中含量较低的ctDNA的含量。

技术实现思路

[0005]为了提高ctDNA检测的准确率和灵敏度，本申请提供一种优化ctDNA检测准确率的方法。
[0006]第一方面，本申请提供一种优化ctDNA检测准确率的方法，采用如下的技术方案：一种优化ctDNA检测准确率的方法，包括以下步骤：S1、血液样本处理：将血液样本收集于抗凝管中，在采血2h内进行以下操作：将血液样本在1
‑
4℃下，16000
‑
20000g离心，取上层血浆；S2、ctDNA的抽离：将上清液经裂解液处理后，加入蛋白质酶解剂和二氧化硅，酶解后，在1
‑
4℃下，2000
‑
2500g离心，取下层沉淀物，加入EB缓冲液，于50
‑
56℃下敞口水浴15
‑
20min，取出，在室温下，1800
‑
2000g离心3
‑
6min，取上清液作为ctDNA样本，在
‑
(20～80)℃下保存；S3、ctDNA样本中间处理：将ctDNA样本以10
‑
20℃/h的升温速率回温至1
‑
10℃，然后每2
‑
3h在1
‑
10℃下超声1次，超声时间为5
‑
10min；S4、ctDNA含量检测：将ctDNA样本进行PCR扩增，将扩增后的ctDNA与生物传感器混合，在2
‑
8℃下杂交反应，检测荧光强度。
[0007]通过采用上述技术方案，因ctDNA浓度低且高度碎片化，所以富集和分离就显得尤为重要，本申请中将血液样本经过先低速再高速的两次离心，以足够的离心力将血液分离出不含细胞成分的上层清液，然后进行游离DNA的抽离，上层清液在裂解液的作用下，可溶性蛋白从上层清液中抽离，然后在蛋白质酶解剂的作用下使蛋白质水解，二氧化硅能使上层清液总血浆纯化，从而最大限度的去除蛋白、色素、脂类等，增大ctDNA的纯度，然后在低温下储存，保持其稳定性。
[0008]因为ctDNA的不稳定性，在进行提取时，为保证准确性，需要在同一天进行同一批样本的提取，但即使在同一天，不同时间内由于ctDNA的降解，也会存在检测结果差异较大的情况，因此将低温存储的血液样本在需要对其进行检测时，将血浆样本取出后以缓慢的升温速度，升温至1
‑
10℃，在1
‑
10℃下进行超声，使血浆充分分散，防止有沉淀，并提高ctDNA的待检测稳定性，从而提高检测准确率和灵敏度。因电化学DNA传感器具有高灵敏度、高特异性和低成本等优点，能将DNA识别探针固定在电极上，通过特异性杂交捕获靶标DNA分子，随后将传感器信号转化成电化学信号，进一步改善检测的准确率。
[0009]优选的，所述步骤S1中，向抗凝管的内壁上均匀喷涂防粘剂，然后置于60
‑
80℃下干燥，防粘剂包括以下重量份得到组分：3
‑
5份透明质酸钠、2
‑
2.5份烷基磷酸酯二乙醇胺盐、1
‑
1.5份肝素化壳聚糖、0.2
‑
0.5份漂洗蒙脱石粉、10
‑
15份乙醇。
[0010]因血液对抗凝管的吸附力较强，容易粘附在抗凝管内壁，且抗凝管为塑料材质，在运输或拿取过程中，会产生静电，造成血液吸附在抗凝管内壁，离心时不能完全使血液从抗凝管内壁剥离，影响细胞分离效果，从而使血浆收率较低。通过采用上述技术方案，在抗凝管的内壁上喷涂防粘剂，透明质酸钠能在抗凝管内壁形成光滑面，防止血液挂壁，烷基磷酸酯二乙醇胺盐能防止抗凝管产生静电，而在漂洗蒙脱石粉的作用下，肝素华壳聚糖能与血小板膜上受体结合释放出收缩酶，促使血液凝块中纤维蛋白网状结构收缩，血块快速离开管壁而收缩析出血清，获得血浆，不仅能防止血液挂壁，还能快速获得血浆，缩短血清和血浆的分离时间。
[0011]优选的，所述肝素化壳聚糖的制备方法如下：以重量份计，将0.4
‑
0.8份肝素钠溶解于1
‑
2份pH值为4.5
‑
4.7的枸橼酸钠缓冲液中，加入0.4
‑
0.8份1
‑
乙基
‑
3(3
‑
二甲基丙胺)，搅拌均匀后，在2
‑
6℃下放置3
‑
5h，将肝素钠溶液加入到1
‑
2份浓度为3
‑
4％的壳聚糖的醋酸溶液中，在氮气保护下，室温搅拌均匀，离心、干燥后，加入3
‑
6份经异氰酸酯硅烷偶联剂处理的纳米氧化镧，混合均匀后，真空干燥。
[0012]通过采用上述技术方案，首先使用枸橼酸钠缓冲液和1
‑
乙基
‑
3(3
‑
二甲基丙胺)对肝素钠分子上的羧基进行活化，经活化的肝素钠分子上的羧基能与壳聚糖分子链上的氨基形成键合，具有羟基的纳米氧化镧粒子与异氰酸酯硅烷偶联剂反应，即纳米氧化镧粒子表面的羟基与异氰酸酯硅烷偶联剂上的一个
‑
NCO基团发生反应，而异氰酸酯硅烷偶联剂上的另一个
‑
NCO基团能与壳聚糖上的羟基反应，使纳米氧化镧粒子接枝到壳聚糖上，从而提高肝素化壳聚糖的抗凝血作用，延长抗凝血时间，使血液样本在提取后未能及时进行离心处理时，也不会凝结，降低时间因素对血浆提取率的影响，从而提高血浆提取率。
[0013]优选的，所述防粘剂的喷涂量为0.4
‑
0.8mL。
[0014]通过采用上述技术方案，控制防粘剂的喷涂量，使防粘剂均匀粘附在抗凝管内，不在抗凝管内积存，降低防粘剂对血浆提取率的影响。
[0015]优选的，所述步骤S1中，向喷涂了防粘剂的抗凝管中加入分离胶，分离胶由聚硅氧烷、聚丁二烯和二氧化硅在60
‑
80℃下反应3...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、血液样本处理：将血液样本收集于抗凝管中，在采血2h内进行以下操作：将血液样本在1
‑
4℃下，在1
‑
4℃下，16000
‑
20000g离心，取上层血浆；S2、ctDNA的抽离：将血浆经裂解液处理后，加入蛋白质酶解剂和二氧化硅，酶解后，在1
‑
4℃下，2000
‑
2500g离心，取下层沉淀物，加入EB缓冲液，于50
‑
56℃下敞口水浴15
‑
20min，取出，在室温下，1800
‑
2000g离心3
‑
6min，取上清液作为ctDNA样本，在
‑
（20～80）℃下保存；S3、ctDNA样本中间处理：将ctDNA样本以10
‑
20℃/h的升温速率回温至1
‑
10℃，然后每2
‑
3h在1
‑
10℃下超声1次，超声时间为5
‑
10min；S4、ctDNA含量检测：将ctDNA样本进行PCR扩增，将扩增后的ctDNA与生物传感器混合，在2
‑
8℃下杂交反应，检测荧光强度。2.根据权利要求1所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于：所述步骤S1中，向抗凝管的内壁上均匀喷涂防粘剂，然后置于60
‑
80℃下干燥，防粘剂包括以下重量份得到组分：3
‑
5份透明质酸钠、2
‑
2.5份烷基磷酸酯二乙醇胺盐、1
‑
1.5份肝素化壳聚糖、0.2
‑
0.5份漂洗蒙脱石粉、10
‑
15份乙醇。3.根据权利要求2所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，所述肝素化壳聚糖的制备方法如下：以重量份计，将0.4
‑
0.8份肝素钠溶解于1
‑
2份pH值为4.5
‑
4.7的枸橼酸钠缓冲液中，加入0.4
‑
0.8份1
‑
乙基
‑
3（3
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二甲基丙胺），搅拌均匀后，在2
‑
6℃下放置3
‑
5h，将肝素钠溶液加入到1
‑
2份浓度为3
‑
4%的壳聚糖的醋酸溶液中，在氮气保护下，室温搅拌均匀，离心、干燥后，加入3
‑
6份经异氰酸酯硅烷偶联剂处理的纳米氧化镧，混合均匀后，真空干燥。4.根据权利要求2所述的优化ctDNA检测准确率的方法，其特征在于，所述防粘剂的喷涂量为0.4
‑
0.8mL。5.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘涛，王鑫，
申请(专利权)人：武汉承启医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：