从草菇子实体中提取纯化蛋白酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种从草菇子实体中提取纯化蛋白酶的方法。所述方法先将草菇子实体在15℃下处理36

【技术实现步骤摘要】
从草菇子实体中提取纯化蛋白酶的方法


[0001]本专利技术属于蛋白质的提取纯化领域，具体涉及一种从草菇子实体中提取纯化蛋白酶的方法。

技术介绍

[0002]由于蛋白酶的底物特异性、结构及作用机制的不同，其在洗涤剂、医药、食品和皮革等生产过程中均有应用，而来自微生物的蛋白酶比植物蛋白酶应用更为广泛。与动物蛋白酶、植物蛋白酶和细菌蛋白酶对比，真菌分泌的蛋白酶具有多样性，包括胞外蛋白酶、膜结合蛋白酶和胞内蛋白酶，且其在下游工业中明显优于细菌蛋白酶。为得到更多种类的真菌蛋白酶，蘑菇也成为了许多蛋白酶的来源，如从真姬菇(Hypsizigus marmoreus)中得到丝氨酸蛋白酶和从雷丸菌(Laccocephalum mylittae)中得到的金属蛋白酶，这两种的蛋白酶均为中性蛋白酶。中性蛋白酶因其反应条件温和，有较高的催化效率，被广泛应用于食品、医药、饲料等行业。
[0003]草菇(Volvariella volvacea(Bull.ex.Fr.)Sing)别名苞脚菇、兰花菇，是一种热带亚热带高温型食用菌，其子实体在低温下存在自溶现象，宜在15℃下保藏。草菇子实体在15℃储藏过程中，其中性蛋白酶活性逐渐增高，而在36h时其可溶性蛋白含量接近最低点，大量的蛋白质被降解为小分子多肽及氨基酸。因此草菇中中性蛋白酶具有较强的裂解能力，在食品、洗涤等方面具有应用潜力。目前，对于草菇中蛋白酶纯化常采用子实体作为蛋白酶来源，且均是从低温处理子实体后提取草菇蛋白酶。文献1(陈明杰,陈恩,王南,等.草菇蛋白酶的分离与纯化[J].食用菌学报,1999,6(4):46
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48.)报道了一种草菇蛋白酶的分离与纯化方法，通过Sephadex G
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150纯化草菇中的蛋白酶，最终得到三个蛋白峰，但只有一个有活性，提取效率低，且未验证其纯化得到的蛋白酶纯度，表明其实验设计不完整。文献2(李世贵,陈明杰.草菇蛋白酶的分离、纯化及等电点的测定[J].菌物系统,2003(02):161
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164.)通过硫酸铵沉淀和Dextran G
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150从草菇中纯化到多个不同等电点的蛋白酶，纯度较低。

技术实现思路

[0004]本专利技术对草菇子实体在15℃下处理36
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96h后，对其所产蛋白酶系进行分离纯化，对获得的蛋白酶进行酶学性质研究，并研究其在酶解大豆分离蛋白中的应用。本专利技术提取的草菇子实体中性蛋白酶的酶活性高、纯度高，提取纯化方法效率高。
[0005]实现本专利技术目的的技术方案如下：
[0006]从草菇子实体中提取纯化蛋白酶的方法，具体步骤如下：
[0007](1)草菇子实体在15℃下处理36
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96h后，将草菇子实体中加入蒸馏水，匀浆，4℃下静置，离心，保留上清，得到粗蛋白酶液，再在粗蛋白酶液中加入硫酸铵达到80％的饱和度，4℃下静置，离心，去除上清液后，用蒸馏水对沉淀进行溶解，然后用10kDa的透析袋进行透析，最后将透析后的液体冻干并保存；
[0008](2)将步骤(1)冻干后的固体溶于20mM、pH7.0的磷酸缓冲液中，得到草菇子实体中性蛋白酶液，酶液经微孔膜过滤后上样，用20mM、pH7.0的Tris
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HCl缓冲液平衡DEAE FF离子柱，用1M NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，在得到主要吸收峰分离梯度后，调整洗脱梯度，依次用20％、60％和100％的1M NaCl溶液进行洗脱，最后得到吸收峰，并对吸收峰进行蛋白含量与酶活性的测定，通过比酶活确定主要吸收峰1；
[0009](3)对主要吸收峰1用Superdex 75 10/300GL的凝胶柱进行纯化，先用20mM、pH7.0的磷酸缓冲液对凝胶柱进行平衡，上样后用含0.1M NaCl的20mM、pH7.0的磷酸缓冲液进行洗脱，流速为0.3mL/min，最后得到吸收峰，对吸收峰进行蛋白含量与酶活性的测定，确定主要吸收峰2；
[0010](4)对主要吸收峰2的浓缩液进行SDS
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聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到分子量大小为20kDa的草菇子实体中性蛋白酶。
[0011]优选地，步骤(1)中，草菇子实体与蒸馏水的料液比为1：10，静置时间为2h，离心速率为5000～6000r/min，透析时间为36h。
[0012]优选地，步骤(1)中，采用30kDa大小的超滤浓缩管对透析后的样品进行级分，去除杂蛋白，进一步地提高凝胶柱层析的纯化效果。
[0013]优选地，步骤(2)中，微孔膜的孔径为0.45μm。
[0014]优选地，步骤(4)中，主要吸收峰2的浓缩液利用大小为3kDa的浓缩管浓缩制得。
[0015]本专利技术还提供上述提取纯化方法制得的草菇子实体中性蛋白酶。
[0016]本专利技术的草菇子实体中性蛋白酶的最适反应pH为7，最适反应温度为40℃，Fe
2+
对草菇子实体中性蛋白酶分解酪蛋白有促进作用，其余金属离子(Ca
2+
、Ni
2+
、Co
2+
、Cu
2+
、Zn
2+
、Mg
2+
)都存在不同程度的抑制作用，蛋白酶抑制剂与表面活性剂对草菇子实体中性蛋白酶存在不同程度的抑制作用。
[0017]进一步地，本专利技术提供上述草菇子实体中性蛋白酶在酶解大豆分离蛋白中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0019](1)本专利技术通过将草菇子实体在15℃下处理36
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96h后，按一定料液比匀浆，用硫酸铵沉淀后进行透析除盐，随后使用离子柱和凝胶柱进行层析，从而去除杂蛋白，纯化方法简单，耗时较短，在纯化过程中可最大程度保持草菇子实体中性蛋白酶的理化性质与生物活性，纯化得到的草菇子实体中性蛋白酶的酶活高且纯度高；
[0020](2)本专利技术的草菇子实体中性蛋白酶在酶解大豆分离蛋白后，酶解液中疏水氨基酸的占比高于胰蛋白酶解液中的，可有效降低水解液中苦味，在食品行业具有广泛的应用前景。
附图说明
[0021]图1为实施例1中DEAE
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FF离子柱洗脱峰1图；
[0022]图2为实施例1中Superdex 75 10/300GL凝胶柱洗脱峰2图；
[0023]图3为对比例1中DEAE
‑
FF离子柱洗脱峰3图；
[0024]图4为对比例1中Superdex 75 10/300GL凝胶柱洗脱峰4图；
[0025]图5为实施例1中SDS
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PAGE电泳图谱；
[0026]图6为实施例2中不同pH下酶活性变化图；
[0027]图7为实施例2中不同温度下酶活性变化图；
[0028]图8为实施例2中不同金属离子下酶活性变化图；
[0029]图9为实施例2中不同化学试剂下酶活性变化图；
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.从草菇子实体中提取纯化蛋白酶的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)草菇子实体在15℃下处理36
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96h后，将草菇子实体加入蒸馏水，匀浆，4℃下，离心，保留上清，得到粗蛋白酶液，再在粗蛋白酶液中加入硫酸铵达到80％的饱和度，4℃下静置，离心，去除上清液后，用蒸馏水对沉淀进行溶解，然后用10kDa的透析袋进行透析，最后将透析后的液体冻干并保存；(2)将步骤(1)冻干后的固体溶于20mM、pH7.0的磷酸缓冲液中，得到草菇子实体中性蛋白酶液，酶液经微孔膜过滤后上样，用20mM、pH7.0的Tris
‑
HCl缓冲液平衡DEAE FF离子柱，用1M NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，在得到主要吸收峰分离梯度后，调整洗脱梯度，依次用20％、60％和100％的1M NaCl溶液进行洗脱，最后得到吸收峰，并对吸收峰进行蛋白含量与酶活性的测定，通过比酶活确定主要吸收峰1；(3)对主要吸收峰1用Superdex 75 10/300GL的凝胶柱进行纯化，先用20mM、pH7.0的磷酸缓冲液对凝胶柱进行平衡，上样后用含0.1M NaCl的20mM、pH7.0的磷酸缓冲液进行洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵妍，李治平，陈明杰，余昌霞，李正鹏，仝宗军，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：