一种中国水仙花器官形态建成期的显微取样方法技术

本发明专利技术涉及植物组织取样方法技术领域，具体涉及一种中国水仙花器官形态建成期的显微取样方法。本发明专利技术提供的显微取样方法包括：先剥出花苞、剥离苞片，再依次剥离第1轮花被、第2轮花被、雄蕊或瓣化雄蕊，最后剥离副冠

【技术实现步骤摘要】
一种中国水仙花器官形态建成期的显微取样方法


[0001]本专利技术涉及植物组织取样方法
，具体涉及一种中国水仙花器官形态建成期的显微取样方法。

技术介绍

[0002]花是高等植物的主要生殖器官，是研究植物进化、分类的重要依据。植物花发育过程是一个复杂的多步骤过程，该过程由一系列内源因素和外源因素共同导致分生组织细胞的转变，并引发花发育的启动。分生组织细胞分化过程为：茎尖分生组织先转变为花序分生组织，进而产生花分生组织，最后再分化成各轮花器官，最终完成各个花器官的形态建成。双子叶植物花结构一般为四轮同心圆，典型花结构由几部分组成，分别是萼片、花瓣、雄蕊、心皮，分别形成花萼、花冠、雄蕊群和雌蕊群等花器官，其中花萼和花冠统称花被。近年来模式植物拟南芥、矮牵牛和金鱼草等遗传学及生物学研究推动了双子叶植物花器官研究进程，双子叶花器官相关基因功能研究为花形态学的发展提供有力证据。20世纪90年代，通过对拟南芥和金鱼草中同源异型突变体进行系统遗传学分析，植物学家提出了花器官ABC模型假说，用来解释植物花器官特性。近期反向遗传学研究表明，另外两种类型的同源基因同样在调控花形态建成方面起重要作用，这两类基因分别是D类基因和E类基因，其中D类基因主要参与胚珠的发育，而E类基因参与调控所有花器官的形成及发育。ABCDE模型从蛋白层面上理解为“四聚体模型”，即同源或异源二聚体蛋白再聚合成四聚体参与下游靶基因的转录调控。
[0003]水仙属是石蒜科(Amaryllidaceae)多年生草本植物，具有地下膨大鳞茎，叶线形，基生，包围花葶，因其特有的副冠形态而被人们所熟知。水仙花色、花型丰富，在插花、盆景、园林景观等领域应用广泛，水仙花中提取的凝集素成分被用于治疗阿尔兹海默症和艾滋病。水仙属现有品种2万余个，国际通用的水仙栽培品种分类标准由英国皇家园艺协会(RHS)制定，即12个园艺学分类和1个植物学分类，分别是：喇叭水仙群(Trumpet Daffodil group)、大杯水仙群(Large
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Cupped Daffodil group)、小杯水仙(Small
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Cupped Daffodil group)、重瓣水仙群(Double Daffodil group)、三蕊水仙群(Triandrus Daffodil group)、仙客来水仙群(Cyclamineus Daffodil group)、丁香水仙群(Jonquilla Daffodil group)、多花水仙群(Tazetta Daffodil group)、红口水仙群(Poeticus Daffodil group)、围裙水仙群(Bulbocodium Daffodil group)、裂冠水仙(Split Corona Daffodil group)、诗人水仙(Poetaz Daffodils group)和自然种类(Daffodils distinguished solely by botanical name)。
[0004]中国自然分布1种水仙——中国水仙(Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem)。中国水仙起源问题一直悬而未决，主要包括地中海起源和中国本土起源两种说法，但多数学者认为中国水仙是多花水仙(N.tazetta L.)的一个变种，而英国皇家植物园(RBG)编撰的检索表将中国水仙定为多花水仙亚种(WCSP,World Checklist of Selected Plant Families)。中国水仙作为传统十大名花之一，以其优美的花型、独特的花香而被大
众所熟知。中国水仙有两个商品化品种，单瓣的
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金盏银台
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和重瓣的
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玉玲珑
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。
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金盏银台
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花萼(sepal)瓣化，与花瓣(petal)形似，各3瓣交互对生，乳白色；副冠(corona)呈酒杯状，黄色，着生于花被管上；雄蕊(stamen)6枚，上下各3枚；雌蕊(pistil)1枚，柱头3裂，子房下位。
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玉玲珑
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副冠和雄蕊均瓣化，12裂瓣白色成簇状排列，黄色裂瓣较小，白色黄色相间；具退化的雌蕊。多数研究人员认为，重瓣
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玉玲珑
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是单瓣
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金盏银台
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的栽培变种。此外，中国水仙
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金盏银台
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自然变异种
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金三角
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、
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金边
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，
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玉玲珑
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自然变异种
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绿玉玲珑
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等也见诸报道，但其观赏价值和商品化应用均较为薄弱。
[0005]近年来，人们对水仙花型、花色、花香的研究与日俱增，但大多数集中在同源基因的克隆上。由于水仙属植物基因组较大，目前尚没有全基因组测序的进展。在转录组水平上，水仙花色研究持续取得成果，比较而言，在水仙花器官分化与器官发育研究方面虽有个别报道，但尚没有实质性进展。
[0006]水仙副冠的结构起源一直是研究学者们争论的热点。与4轮同心圆花结构区分萼片和花冠不同，水仙无明显萼片，2轮花被具有相似的结构，统称花被片。部分学者认为水仙副冠是花被延伸发育成的舌叶或花瓣托叶融合体或雄蕊的变异体。另一篇报道中认为副冠与雄蕊不相关，是从花被管上发育而来。这样的争论持续了一个多世纪。不同形态发生起源的系统发育数据表明，水仙副冠在世系中平行进化了多次。
[0007]水仙副冠是水仙属植物标志性表型，但由于受取样方法的局限性，对其发育机理和演化过程知之甚少，
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玉玲珑
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的副冠和雄蕊瓣化分子机理尚未被充分揭示。花发育研究的基础是科学规范的取样方法。前述研究中，涉及到花发育的取样方法，取样部位均为分化期的花序总苞，而对各个花器官形态建成机制进行研究，有必要对各个花器官单独取样并开展转录组学研究。
[0008]激光辅助显微切割技术(Laser Microdissection,LMD)可以在显微镜下快速准确地分离、获取单一的细胞类群，甚至单个细胞，成功地解决了组织中细胞的异质性问题，主要包括激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)、激光辅助显微切割(Laserassisted microdissection,LAM)及压力弹射激光显微切割(laser microdissection and pressure catapulting,LMPC)等。有研究报道将LAM和超低RNA测序(RNA
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seq)结合对拟南芥胚胎的表皮细胞开展转录组学研究。然而，激光显微切割技术对实验人员的操作技能要求过高，很难实际应用，目前在水仙属植物中尚无应用的案例。因此，开发一种精准高效的徒手微量取样方法对于研究水仙花发育和形态建成具有重要意义。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中国水仙花器官形态建成期的显微取样方法，其特征在于，包括：先剥出花苞、剥离苞片，再依次剥离第1轮花被、第2轮花被、雄蕊或瓣化雄蕊，最后剥离雌蕊
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花托组合体或副冠
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雌蕊
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花托组合体；其中，在副冠形成前，剥离第1轮、第2轮花被的方法如下：在体视显微镜下，将解剖针针尖横放于第1轮花被顶部的彼此交合处，沿花被交合处向下用力压离花被顶部，再用解剖针针尖插入花被内侧向外用力剥离，得到剥离的第1轮花被；在剥离第1轮花被后，在体视显微镜下，将解剖针插入花被与雄蕊或瓣化雄蕊之间，向外用力直至花被瓣尖向下甚至贴于花托，用解剖针针尖刺入花被按顺时针或逆时针旋转用力撕下花被，得到剥离的第2轮花被。2.根据权利要求1所述的中国水仙花器官形态建成期的显微取样方法，其特征在于，在副冠形成后，剥离第1轮、第2轮花被的方法如下：将解剖镊的一个镊尖横放于花被顶部的彼此交合处，沿花被交合处向下用力压离花被顶部，再用解剖镊夹住花被内外两侧斜向下用力撕离，依次得到剥离的第1轮、第2轮花被。3.根据权利要求1或2所述的中国水仙花器官形态建成期的显微取样方法，其特征在于，在雄蕊或瓣化雄蕊发育初期，所述雄蕊或瓣化雄蕊的剥离方法为：用解剖针针尖自外向内挑起，得到剥离的雄蕊或瓣化雄蕊。4.根据权利要求1或2所述的中国水仙花器官形态建成期的显微取样方法，其特征在于，在雄蕊或瓣化雄蕊发育中后期，所述雄蕊或瓣化雄蕊的剥离方法为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡陶，马艳军，江泽慧，王雁，胡晓萌，范可可，邓雅云，
申请(专利权)人：国际竹藤中心，
类型：发明
国别省市：