一种酸性莼菜多糖及其分离纯化方法和应用技术

本发明专利技术涉及多糖分离纯化方法及应用领域，具体涉及一种酸性莼菜多糖及其分离纯化方法和应用。首先制备粗多糖，然后脱蛋白，采用DEAE

【技术实现步骤摘要】
一种酸性莼菜多糖及其分离纯化方法和应用


[0001]本专利技术涉及多糖分离纯化方法及应用领域，特别涉及一种酸性莼菜多糖及其分离纯化方法和应用。

技术介绍

[0002]多糖是植物细胞壁和细胞中普遍存在的重要成分，其理化特性和生物活性因其组成结构的不同而有所不同。研究表明，多糖具有抗肿瘤、抗氧化和免疫调节作用等多种生物活性。近年来，新型多糖的提取、纯化、结构分析和药物研究越来越受到关注。
[0003]莼菜是多年生水生宿根草本，主要分布于中国江西、浙江、江苏等地。它生长在池塘、湖泊和沼泽中，是一种珍贵的食品和药物两用植物，具有清热解毒、利水、消肿等功效。莼菜富含多种化学成分，如多糖、多酚、蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素，多糖作为其主要的营养成分，被认为具有多种保健和药用价值。近年来，大量研究表明莼菜多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血糖等生物活性，莼菜多糖在保健与医疗方面的应用具有广阔的研究前景。
[0004]然而，尽管之前对于莼菜多糖的提取和分离有了一定的研究，但对于莼菜嫩叶中酸性多糖的结构及生物活性研究尚未见相关报道，特别是其体外抗氧化和抗肿瘤活性方面的研究，并且对于其结构与生物活性之间的相关性还没有明确的解释。这些问题都阻碍了莼菜资源的综合利用与深加工。
[0005]中国专利申请号201910344565.4，专利名称一种莼菜多糖的提取方法，公开了如下提取步骤：莼菜先用氢氧化钠溶液洗涤，以酶提法提取，经脱蛋白、超滤膜超滤、醇沉等步骤得到高纯度的莼菜粗多糖。
[0006]尽管上述专利技术可以得到纯度较高的莼菜粗多糖，但对莼菜粗多糖没有进行进一步的分离纯化，对多糖的结构没有深入的研究，活性成分不明确。

技术实现思路

[0007]为了解决现有莼菜多糖分离纯化方法，其多糖成分未得到有效应用的技术问题，本专利技术提供了一种用于莼菜多糖分离纯化的方法，得到一种新型酸性莼菜多糖，同时研究其体外抗氧化和抑制肿瘤细胞增殖的生物活性。
[0008]酸性莼菜多糖的分离纯化方法，按以下具体步骤进行：
[0009]一、制备莼菜粗多糖
[0010]①
将新鲜莼菜嫩叶采用自来水洗净，沥干水分，无水乙醇回流脱脂，烘干，粉碎机粉碎，过100目筛，即得莼菜干粉；
[0011]②
向莼菜干粉中加入蒸馏水，料液比为1:50，加入莼菜干粉质量1～3％的果胶酶，调节溶液pH值3.5～5.5，控制提取温度45～65℃，提取1～3h，90℃灭活10min，过滤去除莼菜干粉，滤液减压浓缩至原体积1/5；
[0012]③
向浓缩液中边搅拌边加入三倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜，离心，得褐色沉
淀物；
[0013]④
沉淀物以适量蒸馏水充分溶解，冷冻干燥，即得莼菜粗多糖；
[0014]二、将莼菜粗多糖以20～30倍蒸馏水复溶，然后向溶液中加入Savage试剂，充分搅拌1h，离心，取上清液，冷冻干燥，即得脱蛋白后的莼菜粗多糖；
[0015]莼菜粗多糖溶液与Savage试剂的体积比为5:1，Savage试剂中氯仿与正丁醇体积比为5:1。
[0016]步骤二的操作重复5～10次，直至离心后液面中间无白色固体。
[0017]三、将步骤二获得的莼菜粗多糖以蒸馏水完全溶解，离心后将上清液一次性上样于DEAE
‑
52纤维柱中，控制流速为1mL/min，分别使用蒸馏水及浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，每10min收集一管，采用苯酚
‑
硫酸法隔管检测洗脱液中多糖含量，绘制洗脱曲线，合并曲线中呈单一峰的洗脱组分，减压浓缩后蒸馏水透析72h，冷冻干燥，即得新型酸性莼菜多糖，完成所述一种新型酸性莼菜多糖的分离纯化方法。
[0018]单糖分析显示，该种多糖主要由D
‑
甘露糖、D
‑
半乳糖、D
‑
木糖和L
‑
岩藻糖组成，其摩尔比为0.08:1.39:1:0.23。红外分析结果表明，该种多糖为α构型的吡喃糖。
[0019]上述方法制备的新型酸性莼菜多糖作为天然抗氧化剂及抑制肿瘤细胞增殖的生物活性成分应用于食品、药品、保健品等领域。
[0020]本专利技术的有益效果是：
[0021]本专利技术建立了一种莼菜多糖的分离纯化方法，使用酶提法提取粗多糖，经脱蛋白，DEAE
‑
52纤维素柱，透析，冻干等操作后，得到了一种纯度极高的新型酸性莼菜多糖，经分析该种多糖分子量约119.5KDa，总糖含量为93.25％并含有30.91％的糖醛酸，研究表明含有糖醛酸结构单元的低聚糖或多糖常显示出十分重要的生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等，因此该多糖展现出潜在的抗氧化及抗肿瘤应用价值。
[0022]经验证，该种多糖具有抗氧化活性，对DPPH、
·
OH和ABTS
+
自由基具有显著的清除作用，且清除率具有浓度依赖性，其半数抑制浓度(IC
50
)分别为1.68、2.28和2.08mg/mL，该多糖对Fe
2+
也具有显著的螯合能力，螯合率随多糖浓度增加而增加，其半数螯合浓度为1.80mg/mL。同时该种莼菜酸性多糖对HepG2、Hela和22RV1肿瘤细胞显示出增殖抑制活性，表现出一定的剂量依赖效应，并且随着给药时间的增加，细胞存活率出现不同程度的下降。综合以上结果说明，该种新型酸性莼菜多糖作为一种全新的多糖，表现出显著的体外抗氧化活性，同时肿瘤细胞增殖抑制研究表明该种多糖可以作为一种广谱的新型抗肿瘤药物。因此，该种新型多糖可以应用于食品、药品、保健品等领域，同时还能推进莼菜深加工，提高莼菜资源的综合利用。
附图说明：
[0023]图1为莼菜粗多糖DEAE
‑
52纤维素柱洗脱曲线；
[0024]图2为实例10得到的精制酸性莼菜多糖BSP
‑
5的紫外全波长扫描图；
[0025]图3为实例10得到的精制酸性莼菜多糖BSP
‑
5的GPC谱图；
[0026]图4为实例10得到的精制酸性莼菜多糖BSP
‑
5及各单糖PMP衍生化后的HPLC谱图；
[0027]图5为实例10得到的精制酸性莼菜多糖BSP
‑
5红外谱图；
[0028]图6为BSP
‑
5对DPPH自由基抑制活性实验结果图；
[0029]图7为BSP
‑
5对羟基自由基抑制活性实验结果图；
[0030]图8为BSP
‑
5对ABTS
+
自由基抑制活性实验结果图；
[0031]图9为BSP
‑
5对Fe
2+
螯合能力实验结果图；
[0032]图10为BSP
‑
5对HepG2肿瘤细胞增殖抑制实验本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酸性莼菜多糖，其特征在于，所述酸性莼菜多糖为性质均一的α构型吡喃糖，由摩尔比为0.08:1.39:1:0.23的D
‑
甘露糖、D
‑
半乳糖、D
‑
木糖和L
‑
岩藻糖组成，平均分子量为119.5KD。2.根据权利要求1所述的酸性莼菜多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述方法步骤如下：(1)、制备莼菜粗多糖
①
将新鲜莼菜嫩叶用自来水洗净，沥干水分，无水乙醇回流脱脂，烘干，粉碎机粉碎，过100目筛，即得莼菜干粉；
②
向莼菜干粉中加入蒸馏水，加入果胶酶，调节溶液pH值，控制提取温度进行提取，90℃灭活10min，过滤去除莼菜干粉，滤液减压浓缩至原体积1/5；
③
向浓缩液中边搅拌边加入三倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜，离心，得褐色沉淀物；
④
沉淀物以蒸馏水充分溶解，冷冻干燥，即得莼菜粗多糖；(2)、将莼菜粗多糖以20～30倍蒸馏水复溶，然后向溶液中加入Savage试剂，充分搅拌1h，离心，取上清液，冷冻干燥，即得脱蛋白后的莼菜粗多糖；(3)、将步骤(2)获得的莼菜粗多糖通过DEAE
‑
52纤维素柱进行分离纯化，得酸性莼菜多糖。3.根据权利要求2所述的酸性莼菜多糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐德锋，祁久乐，胡航，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：