工程化的人内源性病毒样颗粒及使用其递送至细胞的方法技术

人源病毒样颗粒(heVLP)，其包含在外侧的、包含具有一种或多种HERV衍生的包膜蛋白的磷脂双层的膜；在所述膜内侧的、在所述heVLP核心中的一种或多种HERV衍生的GAG蛋白、和置于所述heVLP的核心中的载物分子，例如生物分子和/或化学载物分子，其中所述heVLP不包含除了在人基因组中编码的gag蛋白或源自在人基因组中发现的gag蛋白的共有序列编码的gag蛋白以外的gag蛋白，以及使用其将所述载物分子递送至细胞的方法。细胞的方法。细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化的人内源性病毒样颗粒及使用其递送至细胞的方法
[0001]优先权要求
[0002]本申请要求于2019年6月13日提交的美国专利申请系列号62/861,186的权益。其全部内容通过引用并入本文。
[0003]联邦资助的研究或开发
[0004]本专利技术由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号GM118158在政府的支持下完成。美国政府享有本专利技术的某些权利。


[0005]本文描述了工程化的人内源性病毒样颗粒(heVLP)，其包含在外侧的、包含磷脂双层的膜；和在所述膜内侧的、置于所述heVLP的核心中的载物，例如，生物分子和/或化学载物，其中所述heVLP不包含来自非人gag或pol的蛋白，以及使用其将载物递送至细胞的方法。

技术介绍

[0006]将比如蛋白质、核酸和/或化学品的载物递送至活细胞的胞质溶胶中已是生物治疗发展的一项重大障碍。

技术实现思路

[0007]本文描述了能够将DNA、RNA、蛋白质、化学化合物和/或分子，以及这四种实体的任何组合包装和递送至真核细胞中的heVLP。本文描述的非病毒heVLP系统具有比传统的人工衍生的脂质/金纳米颗粒和基于病毒颗粒的递送系统更简单、更有效和更安全的潜能，这是因为heVLP由人源组分组成。内部的载物可以是或可以不是人源的，但heVLP完全由来自人和合成的非免疫原性组分组成。“合成的”组分包括表面scFv/纳米抗体/darpin肽，这些已被证明不是免疫刺激性的，并可用于增强heVLP的靶向和细胞摄取。这意味着颗粒的外表面缺少显著免疫刺激性的组分，这应该使这些颗粒的免疫原性和抗体中和作用最小化。除载物外，heVLP不含有其他VLP固有的外源性病毒组分，并且这代表了技术的重大的和新颖的进步。此外，heVLP可利用(但不需要)基于化学的二聚物，并且heVLP具有包装和递送载物分子的能力，所述载物分子包括治疗或诊断剂，包括生物分子和化学品，例如，特殊的(specialty)单和/或双链DNA分子(例如，质粒、微环、封闭末端线性DNA、AAV DNA、附加体、噬菌体DNA、同源定向修复模板等)、单和/或双链RNA分子(例如，单向导RNA、引导编辑(prime editing)向导RNA、信使RNA、转移RNA、长链非编码RNA、环状RNA、RNA复制子、环状或线性剪接RNA、微小RNA、小干扰RNA、短发夹RNA、piwi相互作用RNA、支点开关RNA、可由RNA结合蛋白结合的RNA、噬菌体RNA、含有RNA的内部核糖体进入位点等)、蛋白质、化学化合物和/或分子(例如，小分子)，以及上面列出的载物的组合(例如AAV颗粒)。
[0008]本文描述的heVLP不同于传统的逆转录病毒颗粒、病毒样颗粒(VLP)、外泌体(exosome)和其他先前描述的可负载有载物的细胞外囊泡，至少因为heVLP可通过在人细胞
中的人源组分的战略性过表达来生产，heVLP具有很多不同的可能的载物和负载策略，heVLP缺少限制性DNA/RNA长度约束，heVLP缺少源自pol和外源性gag的蛋白质，并且heVLP具有独特的细胞进入的机制。
[0009]本文描述了用于载物递送的组合物和方法，其可与多种多样的蛋白质和核酸分子，包括适用于许多疾病治疗的基因组编辑、表观基因组调节、转录组编辑和蛋白质组调节试剂，一起使用。
[0010]因此，本文提供了工程化的heVLP，其包含在外侧的、包含具有一种或多种HERV衍生的ENV/糖蛋白的磷脂双层(例如，在heVLP生产细胞中，由外源性来源比如质粒或稳定整合的转基因过表达)(例如，如在表1中显示的)的膜；和在所述膜内侧的、置于所述heVLP的核心中的人内源性GAG蛋白、其他细胞质膜募集结构域和/或生物分子/化学载物，其中所述生物分子载物可以或可以不与人内源性GAG或其他细胞质膜募集结构域(例如，如在表6中显示的)融合，并且heVLP不包含非人gag和/或pol蛋白，不表达除了在人基因组中编码的gag蛋白或源自在人基因组中发现的gag蛋白的共有序列编码的gag蛋白以外的gag和/或pol蛋白。在heVLP生产细胞中，与生物分子载物融合的人源GAG或其他细胞质膜募集结构域，可由外源性来源比如质粒或稳定整合的转基因过表达。
[0011]在一些实施方案中，HERV ENV可以是截短的或与scFv或其他靶向多肽融合。
[0012]在一些实施方案中，HERV GAG可与细胞质膜募集结构域(例如，如在表6中显示的)融合。
[0013]在另一实施方案中，工程化的heVLP包含在外侧的、包含具有一种或多种HERV衍生的ENV/糖蛋白(例如，在heVLP生产细胞中，由外源性来源比如质粒或稳定整合的转基因过表达)(例如，如在表1中显示的)的磷脂双层的膜；和，如需要的，细胞质膜募集结构域(例如，如在表6中显示的)；以及，如需要的，在颗粒内的生物分子/化学品。
[0014]还提供了将载物递送至靶细胞例如体内或体外细胞的方法，所述方法通过使细胞与包含作为载物的生物分子和/或化学品的权利要求1的heVLP接触。
[0015]此外，本文提供了用于生产包含生物分子载物的heVLP的方法。所述方法包括提供一种细胞，所述细胞表达(例如，工程化以表达或过表达)一种或多种HERV衍生的包膜蛋白(例如，如在表1中显示的)和载物，其中所述细胞不表达除了在人基因组中编码的gag蛋白或源自在人基因组中发现的gag蛋白的共有序列编码的gag蛋白以外的gag和/或pol蛋白；和将所述细胞维持在使所述细胞生产heVLP的条件下。在一些实施方案中，所述方法还包括收获和任选地纯化和/或浓缩生产的heVLP。
[0016]本文还提供了细胞(例如，分离的细胞，优选地哺乳动物，例如人细胞)，所述细胞以组合表达，例如，已经被诱导过表达，一种或多种HERV衍生的包膜蛋白(例如，(由外源性来源，比如质粒或稳定整合的转基因过表达)(例如，如在表1中显示的)，以及与人内源性GAG或其他细胞质膜募集结构域(例如，如在表6中显示的)融合的载物，其中所述细胞不表达除了在人基因组中编码的gag蛋白或源自在人基因组中发现的gag蛋白的共有序列编码的gag蛋白以外的gag蛋白(由外源性来源，比如质粒或稳定整合的转基因过表达)。在一些实施方案中，所述细胞是原代或稳定的人细胞系，例如人胚肾(HEK)293细胞、HEK293 T细胞或BeWo细胞。所述细胞可用于产生如本文描述的heVLP。
[0017]在一些实施方案中，所述方法包括使用这样的细胞，其已经过或未经过操作以表
达除HERV包膜(例如，如在表1中显示的)以外的任何外源性蛋白，和，如需要的，细胞质膜募集结构域(例如，如在表6中显示的)。在这个实施方案中，通过利用与载物混合的纯化颗粒的核转染、脂质、聚合物、或CaCl2转染、超声处理、冻融和/或热冲击，所生产的“空”颗粒可负载有生物分子或化学分子载物。在所有实施方案中，生产者细胞不表达任何人外源性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种工程化的人源病毒样颗粒(heVLP)，其包含：在外侧的、包含具有一种或多种HERV衍生的ENV/糖蛋白的磷脂双层的膜；在所述膜内侧的、在所述heVLP核心中的HERV衍生的GAG蛋白、和置于所述heVLP的核心中的载物，其中所述载物与人内源性GAG或其他细胞质膜募集结构域融合，并且所述heVLP不包含非人gag和/或pol蛋白。2.根据权利要求1所述的heVLP，其中所述载物是治疗性或诊断性蛋白质或编码治疗性或诊断性蛋白质的核酸，或小分子。3.根据权利要求1所述的heVLP，其中所述载物是基因编辑试剂。4.根据权利要求1所述的heVLP，其中所述基因编辑试剂包含锌指(ZF)、转录激活因子样效应物(TALE)和/或基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白；编码锌指(ZF)、转录激活因子样效应物(TALE)和/或基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白的核酸；或包含基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白的核糖核蛋白复合体(RNP)。5.根据权利要求4所述的heVLP，其中所述基因编辑试剂选自在表2、3、4和5中列出的蛋白质。6.根据权利要求4所述的heVLP，其中所述基因编辑试剂包含基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白，并且所述heVLP还包含一种或多种向导RNA，所述向导RNA结合至所述基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白，并将所述基于CRISPR的基因组编辑或调节蛋白引导至靶序列。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的heVLP，其中所述载物包含与人内源性GAG或其他细胞质膜募集结构域、优选地如在表6中显示的细胞质膜募集结构域的融合物。8.一种将载物分子递送至靶细胞的方法，任选地体内或体外细胞，所述方法包括将所述细胞与包含所述载物分子的如权利要求1所述的heVLP接触，优选地，其中所述载物分子是生物分子和/或化学品。9.一种生产包含一种或多种载物分子的heVLP的方法，所述方法包括：提供一种细胞，所述细胞表达一种或多种HERV衍生的包膜蛋白、一种或多种HERV衍生的GAG蛋白和所述一种或多种载物分子，其中所述细胞不表达除了在人基因组中编码的gag蛋白或源自在人基因组中发现的gag蛋白的共有序列编码的gag蛋白以外的gag和/或pol蛋白；和将所述细胞维持在使所述细胞生产heVLP的条件下。10.根据权利要求9所述的方法，其还包括收获和任选地纯化和/或浓缩生产的heVLP。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述载物分子是治疗性或诊断性蛋白质或编码治疗性或诊断性蛋白质的核酸，或小分子治疗或诊断剂。12.根据权利要求9所述的方法，其中所述载物分子是基因编辑试剂。13.根据权利要求9所述的方法，其中所述基因编辑试剂包含锌指(...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：总医院公司，
类型：发明
国别省市：