一种含外泌体的湖羊精液冻存液及冻存方法技术

本发明专利技术提供了一种湖羊精液冻存液。所述湖羊精液冻存液包含以下浓度的组分：Tris 25～40g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～15g/L、山梨醇5～20g/L、甘油3～10v/v％、BSA 2～7g/L、湖羊间充质干细胞冻干粉0.2～0.8g/L。所述湖羊精液冻存液可以有效降低湖羊精液在冻存过程中的损伤和“衰老”现象，能很好地保持精子的活力和顶体完整性。使用本发明专利技术冻存液和冻存方法对湖羊精液进行超低温冻存，解冻后精子仍然具有较好的授精能力，受胎效果稳定，可满足湖羊冷冻精液人工授精的要求，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种含外泌体的湖羊精液冻存液及冻存方法


[0001]本专利技术属于湖羊养殖
，具体涉及一种含外泌体的湖羊精液冻存液及冻存方法。

技术介绍

[0002]湖羊是太湖平原重要的家畜之一，是我国一级保护地方畜禽品种。畜牧学分类上为羔皮、肉食兼用的粗毛羊。湖羊在太湖平原的育成和饲养已有八百多年的历史。由于受到太平湖的自然条件和人为选择的影响，逐渐育成独特的一个稀有品种，产区在浙江、江苏间的太湖流域，所以称为"湖羊"。
[0003]为提高湖羊的繁殖效率，充分利用优良种公畜的精液，实际生产中已将人工授精技术应用于湖羊的配种中。但羊的精子和鸡、牛精子相比更加脆弱，在冷冻、解冻过程极易形成损伤，从而失去受精能力。现有羊冷冻精液解冻后活率较低且存在很多“衰老”精子和弱死精子，有效精子少，活力低，质量差，很难满足人工授精的需要。而精液的保存是人工受精技术的核心环节，因此开发一种保存效果好的保存液十分必要。
[0004]1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为"exosome"。现今，外泌体特指直径在40
‑
100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体可携带多种与源细胞相似的蛋白质、mRNA、miRNA，参与免疫调节、细胞通讯、细胞迁移、血管新生等过程。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术的目的在于提供一种湖羊精液冻存液，其含有湖羊间充质干细胞冻干粉，在用于湖羊精液冻存时能有效保持湖羊精子的存活率、活力和顶体完整性，有效防止精子的损伤和“衰老”。
[0006]具体技术方案为：
[0007]一种湖羊精液冻存液，其包含以下浓度的组分：Tris 25～40g/L、柠檬酸 15～18g/L、果糖5～15g/L、山梨醇5～20g/L、甘油3～10v/v％、BSA 2～7g/L、湖羊间充质干细胞冻干粉0.2～0.8g/L。
[0008]在其中一些实施例中，所述的湖羊精液冻存液包含以下浓度的组分：Tris30～35g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～10g/L、山梨醇10～20g/L、甘油5～10v/v％、 BSA 2～5g/L、间充质干细胞冻干粉0.2～0.5g/L。
[0009]在其中一些实施例中，所述的湖羊精液冻存液还包括抗生素。
[0010]在其中一些实施例中，所述抗生素及使用量如下：青霉素80～100万IU/L、链霉素0.8～1g/L。
[0011]在其中一些实施例中，所述湖羊间充质干细胞冻干粉制备方法如下：
[0012](1)无菌条件下收集湖羊脐带；
[0013](2)清洗残留的血液，分离获得华通氏胶，然后将其剪成小块，加入Ⅱ型胶原蛋白酶，于37℃消化得到单细胞悬液，加入PBS终止消化，离心，向细胞沉淀中加入含血清的羊脐带间充质干细胞培养液，吹打均匀后接种于培养板中进行培养；
[0014](3)待步骤(2)中培养的细胞融合度达到80～90％时，对细胞进行传代培养；
[0015](4)取传代至3～5代的细胞，用PBS缓冲液清洗，然后用无血清羊脐带间充质干细胞培养液培养48h，收集培养上清液；
[0016](5)从上述上清液中分离获得外泌体，真空冷冻干燥，得到外泌体冻干粉。
[0017]在其中一些实施例中，步骤(5)所述分离获得外泌体的方法为离心法，具体如下：300g离心10min，取上清；2000g离心10min，取上清；10000g离心 30min，取上清；100000g离心70min，取沉淀；用PBS重悬沉淀，然后100000g 离心70min，收集沉淀，即得所述外泌体。
[0018]本专利技术还提供了所述湖羊精液冻存液在湖羊精液保存中的应用。
[0019]本专利技术还提供了一种湖羊精液保存方法，包括以下步骤：
[0020](1)取新鲜湖羊精液，将所述精液加入所述湖羊精液冻存液中，混合均匀后加入冻存管；
[0021](2)将冻存管于4℃放置1～2h，然后于距离液氮液面4～6cm处放置8～ 10min，最后投入液氮中进行保存。
[0022]在其中一些实施例中，所述步骤(1)冻存管中精子的密度为2
×
108～6
×
108个/mL。
[0023]本专利技术经过研究发现，将湖羊间充质干细胞冻干粉用于制备湖羊精液冻存液，并通过组分的优化获得了一种稳定高效的湖羊精液冻存液，其可以有效降低湖羊精液在冻存过程中的损伤和“衰老”现象，能很好地保持精子的活力和顶体完整性。使用本专利技术冻存液和冻存方法对湖羊精液进行超低温冻存，解冻后精子仍然具有较好的授精能力，受胎效果与鲜精接近，可满足湖羊冷冻精液人工授精的要求，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
[0024]为了便于理解本专利技术，下面将参照实施例对本专利技术进行更全面的描述，以下给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
[0025]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0026]实施例1
[0027]本实施例一种湖羊精液冻存液，包含以下浓度的组分：Tris 30g/L、柠檬酸 16g/L、果糖8g/L、山梨醇10g/L、甘油7.5v/v％、BSA 3g/L、间充质干细胞冻干粉0.3g/L、青霉素100万IU/L、链霉素1g/L。
[0028]所述湖羊间充质干细胞冻干粉制备方法如下：
[0029](1)无菌条件下收集湖羊脐带；
[0030](2)清洗残留的血液，分离获得华通氏胶，然后将其剪成小块，加入浓度为1mg/mL的Ⅱ型胶原蛋白酶，于37℃消化6h得到单细胞悬液，加入PBS终止消化，离心，弃上清，向细胞沉淀中加入含血清的羊脐带间充质干细胞培养液，吹打均匀后接种于培养板中进行培养；
[0031](3)待步骤(2)中培养的细胞融合度达到80～90％时，对细胞进行传代培养：弃培养上清，加入0.25％胰酶，于37℃消化2～3min，待细胞变圆脱落，加入PBS终止消化，离心弃上清，细胞用入含血清的羊脐带间充质干细胞培养液进行培养；
[0032](4)收集传代至4代的细胞，用PBS缓冲液清洗，离心弃上清，细胞用无血清羊脐带间充质干细胞培养液培养48h，收集培养上清液；
[0033](5)从上述上清液中分离获得外泌体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种湖羊精液冻存液，其特征在于，包含以下浓度的组分：Tris 25～40g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～15g/L、山梨醇5～20g/L、甘油3～10v/v％、BSA 2～7g/L、湖羊间充质干细胞冻干粉0.2～0.8g/L。2.如权利要求1所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，包含以下浓度的组分：Tris 30～35g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～10g/L、山梨醇10～20g/L、甘油5～10v/v％、BSA 2～5g/L、间充质干细胞冻干粉0.2～0.5g/L。3.如权利要求1所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，还包括抗生素。4.如权利要求3所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，所述抗生素及使用量如下：青霉素80～100万IU/L、链霉素0.8～1g/L。5.如权利要求1所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，所述湖羊间充质干细胞冻干粉制备方法如下：(1)无菌条件下收集湖羊脐带；(2)清洗残留的血液，分离获得华通氏胶，然后将其剪成小块，加入Ⅱ型胶原蛋白酶，于37℃消化得到单细胞悬液，加入PBS终止消化，离心，向细胞沉淀中加入含血清的羊脐带间充质干细胞培养液，吹打均匀后接种于培养板中进行培养；(3)待步骤(2)中培养的细胞融合度达到...

【专利技术属性】
技术研发人员：王争光，曾建露，姚婷，韩强，张云超，王邵雨，陈曦，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：