冻存液及其制备方法与在人肾上皮细胞的应用技术

本发明专利技术公开了一种人肾上皮细胞冻存液及其制备方法与在人肾上皮细胞的应用，本发明专利技术冻存液包括以下质量百分含量的组份：玉米糊精0.001～0.01％、聚甘油1～20％、三羟甲基氨基甲烷0.01～0.05％、L

【技术实现步骤摘要】
冻存液及其制备方法与在人肾上皮细胞的应用


[0001]本专利技术涉及低温冻存
，特别涉及一种人肾上皮细胞冻存液及其制备方法与在人肾上皮细胞的应用。

技术介绍

[0002]哺乳动物细胞作为蛋白的表达系统具有糖基化、乙酰化、硫酸化、硫酸化等翻译后修饰。而蛋白翻译后修饰，如糖基化修饰，会直接影响蛋白在体内的半衰期及稳定性和生物学活性、影响配体识别及结合，影响其免疫原性，影响胞间作用等功能。CHO细胞、BHK细胞、Sp2/0等细胞常被用于制备生物制药。然而这些小鼠来源的细胞与293细胞相比，缺乏人的细胞翻译后修饰系统，因此与人源系统表达的蛋白有差异。目前，293细胞因其具有转染效率高、表达蛋白结构最接近其在人体内构象等优势，被广泛用于生产蛋白、疫苗、抗癌试剂及重组腺病毒包被等。
[0003]在293细胞的科学研究和实际应用中，经常需要将细胞冷冻保存以满足长途运输或长期保存的需求。低温保存过程中不可控制的结冰会对细胞造成严重的机械损伤，从而直接造成细胞直接失活。因此冻存液是293细胞冻存必须使用的一种保护剂，传统的冷冻保存剂通常含有DMSO、乙二醇等小分子物质，这些小分子物质是渗透性的，可透过细胞膜进入细胞内部，增强细胞内水份的玻璃化能力，使细胞内水分在快速降温过程中直接进入玻璃态从而避免结冰。但DMSO具有细胞毒性，浓度越高对细胞危害越大，并且冻存后细胞状态也不佳；其次，含DMSO冻存液在复温过程中也会再次结冰和冰晶重结晶，目前常用的传统冷冻保存剂并不具有控制冰晶成核生长和抑制冰重结晶的效果，因此无法避免复温过程中的冰晶对细胞造成的损伤。

技术实现思路

[0004]针对上述不足，本专利技术的目的在于，提供一种冻存液及其制备方法与在人肾上皮细胞的应用。所述冻存液的配方合理，具有抑制冰核形成、调控冰晶形貌和抑制冰晶重结晶的功能，从而降低冰晶对保存样品的机械损害。
[0005]为实现上述目的，本专利技术所提供的技术方案是：
[0006]一种冻存液的制备方法，其包括以下步骤：
[0007](1)预备以下质量百分含量的组份：玉米糊精0.001％～0.01％、聚甘油1％～20％、三羟甲基氨基甲烷0.01％～0.05％、L
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天门冬氨酸0.001％～0.005％、磷酸二氢钠0.1％～0.4％、磷酸氢二钠0.2％～0.8％、PBS缓冲液10％～25％，余量为水,优选为注射用水；
[0008](2)往所述水中先加入玉米糊精、聚甘油、三羟甲基氨基甲烷，再加入L
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天门冬氨酸搅拌混合均匀，获得混合溶液；
[0009](3)在混合溶液冷却至室温后，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节pH至6.2～8.2，并加入PBS缓冲液定容至预定体积，制得冻存液。
[0010]所述玉米糊精、三羟甲基氨基甲烷、L
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天门冬氨酸可以通过氢键和疏水相互作用，在冰核形成后，特异性地吸附在冰晶晶面上，从而抑制了冰晶生长。并且上述成分在复温过程中，还可以吸附在冰晶界上，阻碍冰畴间水分子的扩散，从而抑制冰晶重结晶，保护细胞免受冻伤。所述聚甘油可以通过羟基和羧基水合部分自由水，降低可结冰水的比例。减少冻存中冰晶生成数量。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和PBS缓冲溶液可调节冻存液的pH，使其维持在6.2～8.2之间。
[0011]一种所述的冻存液在人肾上皮细胞(293)冷冻保存中的应用，应用步骤如下：
[0012](S1)将人肾上皮细胞加入所述的冻存剂中，用移液器吹打混合均匀获得含人肾上皮细胞的冷冻保存液；
[0013](S2)将含人肾上皮细胞的冷冻保存液装入冻存管，然后放入程序降温盒，在室温平衡3～10min；
[0014](S3)将程序降温盒放入
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70～
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90℃的环境中进行梯度降温，降温速率为1℃/min，超过6～8小时后转入液氮长期保存。
[0015]含人肾上皮细胞的冷冻保存液在液氮中存储一段时间后，需要进行复苏并检测人肾上皮细胞状态，其包括如下步骤：
[0016]1)人肾上皮细胞复苏：提前将水浴锅预热至37℃，将冻存管从液氮中取出后迅速放入水浴锅，待其复苏(500μL复苏时间2min左右)；
[0017]2)人肾上皮细胞计数测活率、回收率：吸出一小部分(50μL左右)细胞悬液进行离心前计数，其余加入至3mL提前预热的完全培养基中，离心(转速1000rpm,3min)，去除上清，500μL完全培养基重悬细胞沉淀；
[0018]3)人肾上皮细胞增殖测定：
[0019]3.1)取2)中重悬的细胞悬液：细胞计数；
[0020]3.2)接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数(约4x104cells/mL)，每孔200μL细胞悬液，同样的样本可做4个重复，然后放入37℃培养箱中培养；
[0021]3.3)加入CCK8：在细胞培养箱中分别培养24h、48h和72h后每孔加入20μLCCK8，加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀，然后放入细胞培养箱中孵育1h；
[0022]3.4)测定450nm吸光度：用酶标仪检测波长450nm的吸光度值。
[0023]本专利技术的有益效果为：本专利技术冻存剂的配方合理，可以有效抑制冷冻保存过程中冰晶重结晶过程、调控冰晶形貌、降低冰晶生长速率，减小冰晶对293细胞造成的损伤，同时通过冻存剂中成分与水形成强氢键相互作用降低可结晶水的含量，降低体系内冰晶含量，使得293细胞能够长期于液氮中保存。而且相对于传统冻存剂不包含DMSO等毒性分子和价格昂贵的胎牛血清和蛋白等动物源组分，不仅避免了DMSO对细胞的损害，还降低了生产成本，为人肾上皮细胞在科研和临床医学研究领域的应用提供了强有力的支撑。
[0024]本专利技术提供的冻存剂的制备方法的步骤简单，易于实现，能快速制备出具有抑制结冰和冰晶重结晶、调控冰晶形貌等功能，从而降低冰晶对待保存样品的机械损害。
[0025]下面结合附图与实施例，对本专利技术进一步说明。
附图说明
[0026]图1为PBS溶液对照组和本专利技术冻存液的冰晶重结晶实验结果。
[0027]图2为进口商品化冻存液和本专利技术冻存液的复苏后活率实验结果。
[0028]图3为进口商品化冻存液和本专利技术冻存液的复苏后回收率实验结果。
[0029]图4为293细胞经过进口商品化冻存液和本专利技术冻存液的冷冻保存后复苏后的增殖能力结果图。
[0030]图5为293细胞经过进口商品化冻存液和本专利技术冻存液冷冻保存复苏后培养24、48、72小时的细胞形态图。
具体实施方式
[0031]实施例1：本实施例以人肾上皮细胞的冷冻保存和复苏为例进行说明，但不用来限制本专利技术的限制范围。
[0032](一)冻存剂的制备：取80mL注射水放入置于4
゜
C水浴的烧杯中，放入搅拌子，转速调节至500rpm；加入玉米糊精0.01g、聚甘油5g、三羟甲基氨基甲烷0.3g、L
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种冻存液，其特征在于，其包括以下质量百分含量的组份：米糊精0.001％～0.01％、聚甘油1％～20％、三羟甲基氨基甲烷0.01％～0.05％、L
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天门冬氨酸0.001％～0.005％、磷酸二氢钠0.1％～0.4％、磷酸氢二钠0.2％～0.8％、PBS缓冲液10％～25％，余量为水。2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述的水为注射用水。3.一种冻存液的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：(1)预备以下质量百分含量的组份：玉米糊精0.001％～0.01％、聚甘油1％～20％、三羟甲基氨基甲烷0.01％～0.05％、L
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天门冬氨酸0.001％～0.005％、磷酸二氢钠0.1％～0.4％、磷酸氢二钠0.2％～0.8％、PBS缓冲液10％～25％，余量为水；(2)往所述水中先加入玉米糊精、聚甘油、三羟甲基氨基甲烷，再加入L
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天门冬氨酸搅拌混合均匀，获得混合溶液；(3)在混合溶液冷却至室温后...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵立山，吕健勇，卢思彤，刘红，
申请(专利权)人：松山湖材料实验室，
类型：发明
国别省市：