一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒和提取方法技术

本发明专利技术公开了一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒和提取方法。所述试剂盒包括青链霉素双抗原液、胰蛋白酶／EDTA消化液、IV型胶原酶、α

【技术实现步骤摘要】
一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒和提取方法


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，特别涉及一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒和提取方法。

技术介绍

[0002]肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤间质中最主要的细胞成分，在肿瘤的发生和发展过程中扮演着至关重要的角色。这些肿瘤相关成纤维细胞在形态、功能、蛋白质表达、对细胞因子的反应性及遗传学水平上与正常成纤维细胞存在明显差异。
[0003]肿瘤相关成纤维细胞目前是研究热点之一，该细胞与肿瘤的发生发展和转移侵袭有着密不可分的关系，以肿瘤相关成纤维细胞为靶点的药物成为提高肿瘤治愈率的一种新方法。目前，现有的肿瘤相关成纤维细胞提取方法不能获得大量的肿瘤相关成纤维细胞，提取率较低，为研究其机制及作用带来很大的影响。

技术实现思路

[0004]本专利技术为了解决上述技术问题，提供了一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒和提取方法。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案得以实现的。
[0006]一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，包括青链霉素双抗原液、胰蛋白酶／EDTA消化液、IV型胶原酶、α
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MEM培养基和胎牛血清。
[0007]进一步的，所述青链霉素双抗原液的浓度为10000U／ml。
[0008]进一步的，所述青链霉素双抗的使用终浓度为1%。
[0009]进一步的，所述胰蛋白酶／EDTA消化液为含有0.25%胰蛋白酶、0.04%EDTA的PBS溶液，pH=7.2。
[0010]进一步的，所述IV型胶原酶的使用终浓度为1mg/ml。
[0011]进一步的，胎牛血清的使用终浓度为20%。
[0012]一种提取人原代肝癌成纤维细胞的方法，包括以下步骤：S1. 将肝癌组织放入含1%青链霉素双抗的培养基中，并用含1%青链霉素双抗的培养基洗涤组织，静置1
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2min后，用含1%青链霉素双抗的培养基重复洗涤组织2
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3遍；S2. 弃去洗涤液，加入胰蛋白酶／EDTA消化液，37℃水浴中消化5
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10min；S3. 吸弃胰蛋白酶，加入含1%青链霉素双抗的培养基终止消化，并重复加入1%青链霉素双抗的培养基2
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3次进行洗涤；S4. 吸弃洗涤液，加入胶原酶，37℃水浴消化20
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30min，加含1%青链霉素双抗的培养基终止消化；S5. 3500
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4000r／min离心2
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3min，弃上清，用含1%青链霉素双抗的培养基洗涤胶原酶2
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3遍，重复离心，弃上清；S6.加入含20%胎牛血清、1%青链霉素双抗的α
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MEM培养基，吹打均匀，在37℃、5%
CO2条件下进行培养。
[0013]进一步的，步骤S1中，切取1
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3cm3的肝癌组织。
[0014]本申请具有以下有益效果。
[0015]本申请的试剂盒能够有效提高人肝癌成纤维细胞的原代提取成功率，节省成本并提高工作效率。本申请肝癌成纤维细胞提取方法操作简单，实用性强，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0016]图1是本专利技术培养得到的人肝癌成纤维细胞图。
具体实施方式
[0017]一、本申请试剂盒中每一组分的具体含量试剂1:青霉素链霉素原液（10000U／ml）: 2ml试剂2:胰蛋白酶／EDTA消化液（含0.25%的胰蛋白酶、0.04%的EDTA以0.01mol的PBS溶解，PH≈7.2）:10ml试剂3:胶原酶IV型(粉末):10mg试剂4:α
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MEM(α
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Minimum Essential Medium)（with L
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Glutamine,Ribonucleosides and Deoxyribonucleosides）培养基:10ml试剂5:胎牛血清(Foetal Bovine Serum，FBS ):2ml二、试剂盒的使用方法保存：
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20℃各试剂具体使用方法如下：试剂1：添加到培养基中（可为各种类型培养基，需自备），配制成含1%青链霉素的培养基100ml，用于暂存、转运新鲜肝癌组织，以及后续操作中作为培养基洗液用。
[0018]试剂2:用于消化组织团块。
[0019]试剂3:初次使用时，将胶原酶IV型粉末10mg直接溶解到10ml无血清培养基(可为各种类型培养基，需自备)中，配制成1mg/ml，过滤除菌。再次使用时可分装－20℃冻存。用于消化组织团块。
[0020]试剂4（10ml）+试剂5（2ml）＋试剂1（100ul）配制成含20%FBS、1%青链霉素的α
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MEM培养基，用于原代细胞培养用。
[0021]三、本申请试剂盒有效性验证实验过程：试剂准备：试剂盒试剂1
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5。
[0022]耗材准备：无菌操作器械（解剖剪刀、镊子、手术刀片各1副）；6cm培养皿（1个）；15ml离心管（若干）；50ml离心管（1个）；50ml注射器（1个）；0.22um滤菌器（1个）；巴式吸管（若干）。
[0023]组织准备：组织离体后第一时间切取小块肝癌组织（1cm3左右即可），放入含1%青链霉素双抗的培养基中，要求绝对无菌，尽快转至超净台，然后准备以下操作。
[0024]方法：酶促组织消化法。
[0025]操作如下：1、在含1%青链霉素的培养基中修剪组织块，用器械将组织块修剪成1 平方毫米的碎片，边修剪组织块，边用含1%青链霉素的培养基清洗组织中的血液，将组织块连同洗液转入15ml离心管，静置1～2min，待组织块靠重力下沉后，用含1%青链霉素的培养基重复洗涤2～3遍至透明，以减少血细胞的残留。
[0026]2、弃洗液，加胰蛋白酶／EDTA消化液5ml，37度水浴中消化5～10分钟，至15ml离心管中观察组织凝聚、抱团粘连则提示消化程度为最好。
[0027]3、巴士吸管小心吸弃胰蛋白酶，加含1%青链霉素的培养基终止胰蛋白酶消化，重复加含1%青链霉素的培养基洗涤2～3遍，去除存留的胰蛋白酶。
[0028]4、巴士吸管小心吸弃洗液，加1mg/ml胶原酶IV 3~5ml，转入50ml离心管，37度水浴充分消化20～30分钟，观察至组织块之间黏连成丝则表示消化为最好，加含1%青链霉素的培养基终止消化，转入15ml离心管。
[0029]5、3500转／分钟离心3分钟，弃上清，用含1%青链霉素的培养基洗涤胶原酶2～3遍，重复离心，弃上清，加含20%FBS、1%青链霉素双抗的α
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MEM培养基，适度吹打均匀，转入培养瓶／皿，放37度5%CO2培养箱中培养。
[0030]注意事项：注意污染，严格无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
[0031]避免细胞损伤和减少细胞应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：包括青链霉素双抗原液、胰蛋白酶／EDTA消化液、IV型胶原酶、α
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MEM培养基和胎牛血清。2.根据权利要求1所述的一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：所述青链霉素双抗原液的浓度为10000U／ml。3.根据权利要求1所述的一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：所述青链霉素双抗的使用终浓度为1%。4.根据权利要求1所述的一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：所述胰蛋白酶／EDTA消化液为含有0.25%胰蛋白酶、0.04%EDTA的PBS溶液，pH=7.2。5.根据权利要求1所述的一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：所述IV型胶原酶的使用终浓度为1mg/ml。6.根据权利要求1所述的一种提取人原代肝癌成纤维细胞的试剂盒，其特征在于：胎牛血清的使用终浓度为20%。7.一种提取人原代肝癌成纤维细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1. 将肝癌组织放入含1%青链霉素双抗的培养基中，并用含1%青链霉素双抗的培养基洗涤组织，静置1
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【专利技术属性】
技术研发人员：唐世磊，李航宇，张成宏，何帅，
申请(专利权)人：中国医科大学附属第四医院，
类型：发明
国别省市：