基于血液测序的肿瘤内异质性的评估方法及其用于预测免疫疗法的应答技术

本发明专利技术涉及一种基于血液测序的评估肿瘤内异质性的方法及系统，本发明专利技术还涉及将肿瘤内异质性这一生物标志物用于预测对肿瘤进行免疫疗法的应答，选择用于对肿瘤患者的治疗方法，用于将肿瘤患者分为不同的治疗组，以及用于预测治疗效果中的用途。于预测治疗效果中的用途。

【技术实现步骤摘要】
基于血液测序的肿瘤内异质性的评估方法及其用于预测免疫疗法的应答


[0001]本专利技术属于生物
，更具体而言本专利技术涉及基于血液测序的评估肿瘤内异质性的方法及系统，本专利技术还涉及将肿瘤内异质性这一生物标志物用于选择适合于肿瘤患者的治疗方法，预测肿瘤免疫疗法的应答，或者用于将肿瘤患者分为不同的治疗组，以及用于预测治疗效果中的用途。

技术介绍

[0002]免疫疗法在肿瘤的临床治疗中取得了巨大的成功，然而还是存在着很大一部分肿瘤患者并不会从免疫疗法中获益，这其中的原因并不是清楚。基于免疫检查点抑制剂(immunity Checkpoint inhibitors，ICIs)的免疫疗法在肿瘤的临床治疗中也取得了显著进展。但是基于免疫检查点抑制剂的免疫治疗也存在着有效人群占比不高、耐药等问题，只有约20％的患者能够从ICIs单药治疗中获益。
[0003]现有技术中，突变负荷(tumor mutational burden，TMB)以及新生抗原(neoantigen)是评价免疫疗法是否有效的两大因素。本领域技术人员通常会认为高突变负荷的肿瘤会具有更多的新生抗原，因此更容易产生免疫反应。这样的理论看似符合逻辑和直觉。但是，事实上，免疫疗法对很多低突变负荷的肿瘤仍然有效。可见突变负荷的程度并不能准确地用于预测免疫疗法的功效。因此迫切需要寻找有效的生物标志物来筛选获益人群。
[0004]近年来，肿瘤内异质性(intra
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tumor heterogeneity，ITH)引起大家的关注。肿瘤内异质性，表征的是肿瘤中主克隆和亚克隆的突变的分布情况。肿瘤内异质性程度越高，代表着亚克隆数目更多，突变丰度的多样性程度也越高。

技术实现思路

[0005]本专利技术关注于肿瘤内异质性这一生物标记物。
[0006]本专利技术发现基于血液取样、并基于本专利技术的改进算法所获得的肿瘤内异质性生物指标能有效地用于评价肿瘤患者能否从免疫疗法中获益。
[0007]本专利技术还发现基于血液取样、并基于本专利技术改进的评估方法所获得的肿瘤内异质性生物指标能够有效地用于选择适于免疫疗法的肿瘤患者亚群。
[0008]本专利技术对肿瘤内异质性的评估方法包含如下改进：
[0009](1)基于血液的高通量测序，利用血检中的MSAF概念对检测到的所有肿瘤特异性的突变进行校正，使得样本之间的突变丰度具有可比性；
[0010](2)基于香农多样性公式对肿瘤内异质性评估指标进行加权，所述加权校正了血液的突变分布特征对评估的影响，由此对肿瘤内异质性的判断方法进行优化，并验证了基于血液取样的肿瘤内异质性指标在不同癌种预测免疫治疗疗效、以及选择适合于免疫疗法的患者亚群中的可行性。
Frequency，MSAF)，并将每个突变的VAF除以MSAF，从而将每个突变的VAF归一化，得到一组校正后的分布在0
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1之间的肿瘤突变等位基因频率(tumorVAF)，tumorVAF参数代表突变在肿瘤内的发展程度，tumorVAF的计算参见公式(2)。
[0030][0031]具体地，MSAF为ctDNA测序中最高的变异频率或突变丰度。
[0032]具体地，根据公式(3)，将0
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1按照每0.1划分成一个区间，统计校正后的tumorVAF落入每个区间内的数量，得到一组长度为10的整数数组。
[0033]该数组代表了以0.1为长度的每个tumorVAF分布区间内的突变数量。
[0034][0035]具体地，将该数组除以全部的突变数量，如公式(4)所示，得到以0.1为长度的每个VAF分布区间内的突变分布概率。
[0036][0037]具体地，根据公式(5)，通过香农多样性指数公式(Shannon Diversity Index，SDI)，对每个样本的突变分布多样性进行评估，SDI(/MSAF)数值的大小可以表征肿瘤的异质性程度，数值越大表示肿瘤内异质性越高，反之亦然。
[0038][0039]相对于现有技术中用SDI计算获得的低ITH人群而言，校正后的SDI(/MSAF)指标能更好地预测低肿瘤内异质性的肿瘤患者拥有好的免疫治疗效果。
[0040]进一步地，由于血检数据中tumorVAF的分布非常不均匀，会呈现出tumorVAF越高，突变个数比例越低的分布趋势，由此导致大部分的突变都会集中分布在低tumorVAF的区域。因此在使用SDI(/MSAF)进行异质性评估的时候，会引入估计的偏好性，低tumorVAF的突变个数变化会导致分数的大幅度波动，而高tumorVAF区域的突变较少，个数变化也较少，难以使得分数产生变化。因此，肿瘤内异质性的评估深受突变检出数量的限制。据此，本专利技术针对该现实缺陷，对算法进行了进一步的校正。
[0041]具体地，本专利技术根据tumorVAF的先验分布特征，对原始的SDI(/MSAF)公式给予一个权重函数，权重函数的目的是对较少突变分布的高tumorVAF区域给予更高的权重，而对较多突变分布的低tumorVAF区域给予更低的权重。
[0042]具体地，本专利技术所发现的合适的权重函数有如下：
[0043]1.统计每个分布区间内的tumorVAF的均值得到mean tumorVAF作为权重函数；
[0044]2.固定使用每个tumorVAF分布区间的中值作为权重函数；或
[0045]3.对于数量足够的数据集，可以估计人群的突变分布函数，划分出主克隆区域和
亚克隆区域(默认值可为0.25)，对主克隆区域给予两倍权重。
[0046]更具体地，第八方面，本专利技术提供了一种改进的评估ITH的方法，所述方法包括：
[0047](1)对患者的游离DNA进行测序，获得测序信息；利用所述测序信息确定肿瘤特异性的变异；
[0048](2)利用测序信息和确定的肿瘤特异性的变异，计算每个突变位点的变异等位基因频率(variant allele frequency，VAF)，为突变等位基因测序的深度(depth of mutated allele，Dmut)/该位点的总测序深度；计算公式如下式(1)
[0049][0050]具体地，该位点的总测序深度＝参考等位基因测序深度+变异等位基因测序深度；
[0051]更具体地，参考等位基因测序深度，是测序结果中在相应位点未发生该变异的正常序列的条数；
[0052]更具体地，变异等位基因测序深度，是测序结果中在相应位点发生该变异的变异序列的条数；
[0053]更为具体地，其中所述变异选自单核苷酸变异(SNV)或indel(插入或缺失)；
[0054](3)计算每个样本的最大的体系突变频率(Maximum Somatic Allele Frequency，MSAF)，并将每个突变的VAF除以MSAF,从而将每个突变的VAF归一化，得到一组校正后的分布在0
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1之间的肿瘤突变等位基因频率(tumorVAF)，tumorVAF参本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种评估肿瘤内异质性(bITH)的方法，其特征在于，所述方法包括：a)对患者的游离DNA进行测序，获得测序信息；利用所述测序信息确定肿瘤特异性的变异；b)利用所述测序信息和确定的肿瘤特异性的变异，计算每个突变位点的变异等位基因频率(VAF)；c)将VAF划分为多个区间，计算每个VAF分布区间内的突变分布概率；d)对每个样本的突变分布多样性进行评估，作为bITH指标。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每个突变位点的变异等位基因频率(VAF)，为突变等位基因测序的深度(Dmut)/该位点的总测序深度；计算公式如下式(1)3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：b
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2)计算每个样本的最大体系突变频率(MSAF)，并将每个突变的VAF除以MSAF，从而将每个突变的VAF归一化，得到一组校正后的分布在0
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1之间的肿瘤突变等位基因频率(tumorVAF)，tumorVAF参数代表突变在肿瘤内的发展程度，tumorVAF的计算参见公式(2)4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：c
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2)根据以下公式(3)，将0
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1按照每0.1划分成一个区间，统计校正后的tumorVAF落入每个区间内的数量，得到一组长度为10的整数数组，该数组代表了以0.1为长度的每个tumorVAF分布区间内的突变数量5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：c
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3)将该数组除以全部的突变数量，如以下公式(4)所示，得到以0.1为长度的每个VAF分布区间内的突变分布概率：6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：d
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2)根据公式5，对每个样本的突变分布多样性进行评估，其中，SDI(/MSAF)数值的大小表征肿瘤的异质性程度，数值越大表示肿瘤内异质性越高。7.根据权利要求4
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6中任一项所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：d
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3)利用权重函数，对低tumorVAF区域给予偏低的权重，通过加权后计算获得bITH，
bITH数值越大表示肿瘤内异质性越高。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：(1)统计每个分布区间内的tumorVAF的均值得到mean tumorVAF作为权重函数；或者，(2)固定使用每个tumorVAF分布区间的中值作为权重函数；或者，(3)通过估计人群的突变分布函数，划分出主克隆区域和亚克隆区域(默认值可为0.25)，对主克隆区域给予两倍权重。9.根据权利要求5所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡怡然，李冰，张周，揣少坤，汉雨生，
申请(专利权)人：广州燃石医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：