【技术实现步骤摘要】
一种体外制备环状DNA的方法
[0001]本专利技术属于DNA合成
，涉及一种体外制备环状DNA的方法。
技术介绍
[0002]质粒作为一种分子生物学工具，广泛用于基因表达、RNA转录、基因调控等领域。在质粒的应用过程中，涉及质粒构建、大肠杆菌感受态细胞转化实验、酵母细胞转化实验、动物细胞转染实验等。在真核细胞转染实验中，效率尤为关键。质粒进入真核细胞的效率直接决定了实验效果是否满足需求。真核细胞转染效率与多个因素有关，其中质粒的大小是关键因素之一，同等条件下较小的质粒更容易转染进入细胞。因此，在保留必需功能元件前提下，减小质粒的大小可以提高转染效率。
[0003]近年来，生物安全越发受到社会关注，在生命科学研究领域，生物安全问题需要着重考量。由于质粒构建过程需要借助原核生物大肠杆菌，这就导致质粒本身除了目的元件外，尚存在大量原核生物相关元件，这些原核生物相关元件对于真核细胞而言，一方面是冗余序列，增加了质粒大小，降低转染效率；另一方面是外源序列，是威胁生物安全的外源因素。
[0004]现有两种较成熟的...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种体外制备环状DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，根据目的线性DNA片段，设计Gibson组装连接片段，同时引入限制性内切酶BsaⅠ的识别位点序列，所述的Gibson组装连接片段按照“目的DNA上游25bp+BsaⅠ的识别位点序列+目的DNA下游25bp”设计，反向互补序列一并设计，所述的BsaⅠ识别位点为：5
’
GGTCTCNNNNN3
’
，5
’
CCAGAGNNNNN3
’
，其中N代表碱基A、T、C、G中任意一个，且N不必相同；步骤2，合成Gibson组装连接片段；步骤3，按照目的线性DNA片段和Gibson组装连接片段的摩尔比为1：3进行混合，进行Gibson组装，回收产物；步骤4，以Gibson组装产物为模板，进行滚环扩增，纯化得到RCA产物；步骤5，对纯化的RCA产物进行BsaⅠ酶切，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收与目的线性DNA片段大小一致的酶切条带；步骤6，将上述酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：高杨，刘超，高峰，顾颖，沈玥，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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